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Estudos funcionais e estruturais da proteína LaRPA-1 nos telômeros de Leishmania amazonensis

Processo: 13/19089-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2013
Vigência (Término): 30 de novembro de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Maria Isabel Nogueira Cano
Beneficiário:Paula Maranon Garcia
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IBB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
Assunto(s):Leishmania mexicana

Resumo

Telômeros são complexos proteína:DNA que protegem as extremidades dos cromossomos em eucariotos. Eles conferem estabilidade ao genoma e viabilidade celular, pois evitam fusões e degradações terminais. Os telômeros de Leishmania spp. são compostos por repetições conservadas do tipo TTAGGG e como na maioria dos eucariotos são mantidos pela ação da telomerase. As proteínas que interagem com o DNA telomérico são componentes cruciais que mantém a arquitetura telomérica e regulam a atividade da telomerase. Dentre estas proteínas encontra-se a proteína alvo deste estudo, a RPA-1 que cumpre papel importante nas maquinarias telomérica, de replicação, recombinação e reparo do DNA genômico. Em Leishmania amazonensis, principal agente causal da leishmaniose tegumentar nas Américas, a RPA-1 (LaRPA-1) foi identificada por afinidade à simples-fita telomérica rica em G e por se associar e co-localizar in vivo com os telômeros. Resultados recentes sugerem que LaRPA-1 é homóloga funcional das proteínas CDC13 de levedura e da POT1 de vertebrados as quais fazem parte de complexos proteicos que estão diretamente envolvidos na proteção (capping) e manutenção dos telômeros. Estes complexos atuam controlando tanto a ação da telomerase como da maquinaria de replicação do DNA nos terminais de cromossomos. A proposta deste projeto e o de se compreender o papel da LaRPA-1 nos telômeros de formas promastigotas do parasita. Para tal serão gerados parasitas que super - expressam LaRPA-1 inteira, e os efeitos da superexpressão de LaRPA-1 serão avaliados comparativamente com os parasitas selvagens utilizando diferentes parâmetros tais como: proliferação dos parasitas em cultura, expressão e co-localização subcelular, interação proteína-proteína, análises quantitativas e qualitativas do tamanho dos telômeros pelas técnicas de qPCR e Southern blot e interação in vivo com os telômeros do parasita. Em paralelo será testada a função de LaRPA-1 na replicação do DNA realizando ensaios com parasitas selvagens e superexpressando a LaRPA-1 inteira na presença de inibidores de DNA polimerase alfa (ex: afidicolina). Proteínas recombinantes, selvagem e mutantes, serão utilizadas para se mapear possíveis domínios de interação proteína-proteína utilizando-se ensaio de captura do tipo "pull-down".