Expressão e purificação de cruzaína recombinante a partir de E. coli DH5a

• Processo: 13/21102-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de janeiro de 2014
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2014
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Farmácia
• Pesquisador responsável: Carlota de Oliveira Rangel Yagui
• Beneficiário: Gustavo Muneo Takata
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Biotecnologia Tripanossomíase Purificação de proteínas Fermentação Cruzaína Escherichia coli Cromatografia líquida
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cruzaína | expressão de enzimas | fermentação | Purificação de Proteínas | biotecnologia farmacêutica

Resumo

A tripanossomíase americana ou doença de Chagas é uma doença endêmica cujo agente causal, Trypanosoma cruzi, determina, nos seres humanos, quadros clínicos com características e consequências muito variadas.A cruzipaína é uma cisteína protease expressa em T. cruzi que demonstrou estar relacionada com a virulência e patogenicidade da doença e, portanto, se mostrou um potencial alvo terapêutico. Essa proteína conseguiu ser expressa sob a forma de proteína recombinante em E. coli DH5a, denominando-se cruzaína e apresentando o mesmo sítio de ação que a cruzipaína. Esse projeto visa aperfeiçoar a produção dessa enzima recombinante, determinando as melhores condições de cultivo da bactéria e de purificação da enzima. Para que a mesma possa então ser empregada em ensaios biológicos de compostos potencialmente antichagásicos (inibidores da cruzaína). Inicialmente, serão estudadas as condições de indução da expressão de cruzaína por E. coli (tempo e temperatura). Em seguida, será determinado o melhor protocolo de purificação por meio de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC). Por fim, os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) da cruzaína obtida serão determinados e comparados com os valores disponíveis na literatura.