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Estudo molecular do gene CG2943 no desenvolvimento de estruturas normais e de tumores induzidos por manipulação genética em Drosophila melanogaster

Processo: 13/21242-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de março de 2014
Vigência (Término): 30 de abril de 2017
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Enilza Maria Espreafico
Beneficiário:Carlos Antonio Couto Lima
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Drosophila melanogaster   Mutações induzidas   Células tumorais   Proliferação celular   Interferência de RNA   Inativação gênica   Superexpressão gênica   Sistemas CRISPR-Cas   CRISPR-Cas9

Resumo

O desenvolvimento do câncer é um processo de múltiplos passos, que envolve a cooperação entre mutações em componentes das vias de sinalização, ciclo celular e morte celular, assim como as interações entre o tumor e o microambiente tumoral. Estudos recentes demonstram o poder da D. melanogaster para avaliar esses processos, possibilitando o entendimento molecular de várias vias de sinalização importantes nos processos de desenvolvimento e controle do crescimento celular. Dados recentes de nosso laboratório mostram que o silenciamento de KIAA0090/EMC1 em células de melanoma reduz a taxa de proliferação, migração e sobrevivência celular in vitro e atenua o crescimento tumoral in vivo. Em células de tumor de mama, a superexpressão de KIAA0090/EMC1 aumenta a proliferação e migração celular. Durante nosso projeto de mestrado (FAPESP 2011/16666-2), o direcionamento de um RNAi contra o ortólogo de KIAA0090/EMC1 (CG2943) para musculatura, em D. melanogaster,, gerou um fenótipo de severa deficiência motora no adulto, associada a defeito ultraestrutural nas mitocôndrias das fibras musculares. O direcionamento do RNAi para o tecido precursor (os discos imaginais) das asas gerou animais incapazes de voar e com variados graus de defeitos nesta estrutura, que se assemelham a fenótipos descritos para genes já caracterizados, como Notch. No presente projeto, buscando elucidar vias funcionais e os mecanismos de atuação do produto do gene CG2943 no desenvolvimento de estruturas normais, investiremos: i) na obtenção de anticorpos específicos para caracterizar a expressão tecidual e localização subcelular da proteína endógena; ii) na produção de novos alelos do gene CG2943, utilizando o sistema CRISPR RNA/ Cas9 para induzir deleções do gene inteiro ou de regiões especificas do gene; iii) na geração de linhagens transgênicas carregando CG2943 sob controle de UAS-GAL4 para superexpressão da proteina CG2943, intacta ou fusionada a proteínas fluorescentes, em tecidos específicos; iv) na caracterização dos defeitos fenotípicos em níveis celulares e moleculares, através da combinação de abordagens genéticas com a microscopia de fluorescência confocal e multifóton, consistindo em construir linhagens carregando a interferência sobre CG2943 combinada a marcadores fluorescentes simples ou múltiplos que permitem a aquisição de imagens, in vivo; e v) no estudo de interações genéticas, avaliadas com base em complementação ou modificação fenotípica. Para explorar o papel do gene em câncer, induziremos tumores nos compartimentos dos discos imaginais através da manipulação genética, por mosaicismo, de oncogenes e supressores tumorais, como previamente descrito, e por cruzamento genético com as diferentes linhagens carregando alterações no CG2943, avaliaremos como o silenciamento ou superexpressão de CG2943 influencia a tumorigênese e os processos de crescimento e invasão tumoral. (AU)