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Avaliação dò método dè sequenciamento de nova geração N‚O diagnóstico genético dè neoplasia endócrina múltipla tipo 1

Processo: 13/15388-4
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de março de 2014
Vigência (Término): 31 de janeiro de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
Pesquisador responsável:Delmar Muniz Lourenço Jr
Beneficiário:Rafael Arrabaça de Carvalho
Instituição-sede: Faculdade de Medicina (FM). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Sequenciamento de nova geração   Análise de sequência de DNA   Neoplasia endócrina múltipla tipo 1   Endocrinologia

Resumo

A neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1) é uma doença genética, de herança autossômica dominante, caracterizada pelo desenvolvimento de tumores endócrinos acometendo, principalmente, hipófise, paratireoide, pâncreas/duodeno endócrinos. É causada, principalmente, por mutação germinativa no gene supressor tumoral MEN1 (11q13). A tumorigênese segue o modelo de Knudson (1971). O diagnóstico genético de famílias com MEN1 reconhece os portadores assintomáticos de mutação MEN1, permite o diagnóstico e tratamento precoce de tumores, promove a redução da morbi-mortalidade relacionada à MEN1 e exclui familiares não portadores de mutação do rastreamento clínico periódico. O diagnóstico genético de MEN1 tem sido realizado por meio da técnica de sequenciamento Sanger. Entretanto, limitações desta técnica a tornam menos custo efetiva, devido a sua reduzida capacidade de geração de dados, que leva a necessidade de obtenção de produtos de PCR de até 600 pb para adequada leitura do sequenciamento. Além disto, condições específicas do gene MEN1, como a ausência de "hot spots" mutacionais, levam a necessidade de sequenciamento de toda sua extensão (9Kb) e contribuem para tornar esta técnica laboriosa e dispendiosa. A subdivisão do gene para sequenciamento Sanger pode ocultar informações, principalmente de regiões intrônicas, que podem ser importantes para o desenvolvimento da doença. Tais dificuldades impedem a incorporação do diagnóstico gênico de MEN1 na prática clínica. Desde 2005, estão disponíveis tecnologias denominadas NGS (New Generation Sequencing), que consistem em ferramentas para o sequenciamento genético com capacidade aumentada de geração de dados, tornando-as mais atrativas e de melhor custo benefício. O NGS confere ainda maior velocidade ao processo de obtenção de dados e detém a capacidade de realizar a leitura completa do gene, incluindo regiões promotoras e intrônicas. Por isto, torna a leitura mais ampla e informativa, sem desconsiderar aspectos qualitativos. Dentre várias opções de NGS disponíveis, plataformas leves são consideradas mais adequadas para aplicação clínica, destacando-se as plataformas Ion PGM e Illumina MiSeq. Uma forte tendência tem sido mostrada de migração do sequenciamento Sanger para o NGS, incluindo a aplicação da mesma em diagnóstico genético de doenças complexas e de câncer hereditário. Entretanto, não há estudos prévios envolvendo NGS em MEN1. Diante disto, surge o interesse de avaliar a qualidade desta técnica como método de diagnóstico genético em MEN1 em comparação ao sequenciamento Sanger. Os objetivos são: validação da técnica de NGS utilizando como parâmetro o sequenciamento Sanger; avaliação de aspectos qualitativos e relação custo-benefício do NGS. Para tal, serão analisados 50 casos-índices com MEN1. Em avaliação preliminar, utilizando Ion PGM, foram analisados 4 casos-índices com mutação germinativa previamente conhecida no gene MEN1. Foi obtida uma cobertura média de leitura > 100x, com 100% da região alvo (gene MEN1) com no mínimo 10 reads, permitindo a avaliação com acurácia de todas as mutações germinativas. Também, foi encontrada uma média de 37 SNPs por paciente. Entretanto, inúmeros in/dels foram gerados dificultando a análise dos resultados. Este grande número de in/dels é causado por uma limitação específica da plataforma Ion PGM. Diante disto, optou-se pelo uso da plataforma Illumina MiSeq pela análise dos dados gerados serem fornecidos na própria plataforma, não resultar na geração de falsos in/dels e devido a menor probabilidade de erros frente às sequencias ricas em C-G, comuns no gene MEN1. O enriquecimento da amostra será realizado por meio de "long range PCR" que amplificará toda a região genômica do gene MEN1. Esta reação foi padronizada durante o estudo preliminar com a plataforma Ion PGM e será aplicada com a plataforma Illumina MiSeq. Este projeto pretende, assim, introduzir esta técnica como ferramenta de diagnóstico gênico de MEN1 em nosso meio.

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
CARVALHO, RAFAEL A.; URTREMARI, BETSAIDA; JORGE, ALEXANDER A. L.; SANTANA, LUCAS S.; QUEDAS, ELISANGELA P. S.; SEKIYA, TOMOKO; LONGUINI, VIVIANE C.; MONTENEGRO, FABIO L. M.; LERARIO, ANTONIO M.; TOLEDO, SERGIO P. A.; MARX, STEPHEN J.; TOLEDO, RODRIGO A.; LOURENCO JR, DELMAR M. Germline mutation landscape of multiple endocrine neoplasia type 1 using full gene next-generation sequencing. EUROPEAN JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY, v. 179, n. 6, p. 391-407, DEC 2018. Citações Web of Science: 3.
Publicações acadêmicas
(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)
CARVALHO, Rafael Arrabaça de. Avaliação do método de sequenciamento de nova geração no diagnóstico genético de neoplasia endócrina múltipla tipo 1. 2016. Dissertação de Mestrado - Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina São Paulo.

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