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Aumento da termoestabilidade de uma xilanase termoestável de Thermoascus aurantiacus (GH-10)através de engenharia de proteína, por epPCR e mutação sítio dirigida

Processo: 14/04272-8
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 10 de junho de 2014
Vigência (Término): 09 de dezembro de 2014
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Roberto da Silva
Beneficiário:Angelica Rodrigues de Souza
Supervisor no Exterior: Jeffrey A. Mertens
Instituição-sede: Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de São José do Rio Preto. São José do Rio Preto , SP, Brasil
Local de pesquisa : National Center for Agricultural Utilization Research (NCAUR), Estados Unidos  
Vinculado à bolsa:11/22461-4 - Melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo Thermoascus aurantiacus, expressa em e. coli, por evolução dirigida e desenho racional: produção, purificação, caracterização Bioquímica e Biofísica da enzima, BP.DR
Assunto(s):Enzimas

Resumo

A sacarificação enzimática da biomassa lignocelulósica e o biobranqueamento da polpa de papel constituem estratégias atraentes para o setor de bioprocessos. Xilanases atuam na hidrólise da ligação glicosídica b-1,4 do polímero de xilana e têm sido fortemente aplicadas nestes setores. No entanto, estes processos requerem enzimas tolerantes a condições de elevado estresse ambiental, como extremos de temperatura e/ou pH. A xilanase selvagem (xynA) do fungo termofilico Thermoascus aurantiacus apresentou elevada temperatura ótima de atividade (75°C) e manteve-se estável em ampla faixa de temperatura (de 35°C a 75°C). Assim, a xilanase de T. aurantiacus é uma ótima candidata para estudos de engenharia racional de proteínas para melhorar ainda mais e entender a estabilidade frente à temperatura e pH, por exemplo. Durante execução do projeto de PhD, alguns problemas surgiram e motivaram a construção de um novo plano de trabalho. Neste projeto, o gene de xynA foi clonado em vetor de S. cerevisiae, YPGK-1, expresso em cepa de S. cerevisiae, conforme confirmação no zimograma de atividade xilanolítica. Entretanto, os níveis de expressão no meio de cultura foram muito baixos dificultando a seqüência do trabalho com os ensaios enzimáticos e termoinativação. Posteriormente, o sequenciamento do gene de xynA, clonado em S. cerevisiae, revelou a presença de mutações na enzima nativa, o que possivelmente poderia justificar sua reduzida expressão e atividade. Então estes resultados foram discutidos com PhD. Jeffrey A. Mertens (USDA - Peoria - EUA), um especialista em engenharia de proteínas e expressão de proteínas recombinantes em bactéria e levedura, que se interessou pelo projeto. Projetos potenciais para superar os problemas de expressão e melhoramento da enzima por mutagênese foram propostos e são a motivação para este pedido de estágio de pesquisa no exterior: reconstruir o gene de xynA original (selvagem) por reamplificação da sequencia nativa, clonar o gene de xynA em vetor de E. coli; este plasmídeo será usado como template para construção de biblioteca de mutantes, com o objetivo de aumentar a tolerância térmica e atividade da enzima recombinante. Mas se a enzima (nativa e mutada) forem expressas na fração insolúvel, uma estratégia alternativa será desenvolvida, neste caso o plasmídeo pPIC9-xynA será usado como template para construção da biblioteca de mutantes. Os mutantes serão obtidos por meio da evolução dirigida de enzimas, empregando-se vários rounds de mutações por diferentes técnicas como error-prone PCR (epPCR) e mutação sítio dirigida (MSD). Neste último caso, aminoácidos específicos na sequencia de xynA serão trocados para verificar o impacto em relação a termoestabilidade e atividade da enzima, diferentes estratégias serão testadas e variantes de xilanase mutagênica serão selecionados por ensaios de termoestabilidade. Esta proposta de projeto de estágio no exterior será realizada em parceria com um grande centro de pesquisa, Bioenergy Research Unit do United States Department of Agriculture (USDA) em Peoria - Illinois, que irá fornecer uma contribuição importante para a execução deste trabalho. (AU)

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
DE SOUZA, ANGELICA R.; DE ARAUJO, GABRIELA C.; ZANPHORLIN, LETICIA M.; RULLER, ROBERTO; FRANCO, FERNANDA C.; TORRES, FERNANDO A. G.; MERTENS, JEFFREY A.; BOWMAN, MICHAEL J.; GOMES, ELENI; DA SILVA, ROBERTO. Engineering increased thermostability in the GH-10 endo-1,4-beta-xylanase from Thermoascus aurantiacus CBMAI 756. International Journal of Biological Macromolecules, v. 93, n. A, p. 20-26, DEC 2016. Citações Web of Science: 9.

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