Clonagem molecular e expressão em Trypanosoma brucei da proteína U5-200K para experimentos de purificação em tandem

• Processo: 13/26996-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2014
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2015
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Otavio Henrique Thiemann
• Beneficiário: Camila Maria dos Santos Boralli
• Instituição Sede: Instituto de Física de São Carlos (IFSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 08/57910-0 - Instituto Nacional de Biotecnologia Estrutural e Química Medicinal em Doenças Infecciosas - INBEQMeDI, AP.TEM
• Assunto(s): Trans-splicing Trypanosoma brucei brucei
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Complexo de proteínas | TAP-tag | trans-splicing | Trypanosoma brucei | Biologia Molecular e Estrutural

Resumo

Dada a grande importância médica da família Trypanosomatidae, uma vez que os parasitos protistas desta família são capazes de provocar doenças letais em seus hospedeiros, tem-se investigado os processos moleculares peculiares desses organismos, como o processamento dos pré-mRNAs por Splice-Leader (SL trans-splicing), necessário para resolver os transcritos de RNA policistrônico em mRNAs maduros. Este mecanismo é ausente em vertebrados, nos quais ocorre o cis-splicing, sendo as proteínas participantes consideradas importantes alvos parasito-específicos. O spliceossomo é um complexo nuclear que interage com o SL RNA e o pré-mRNA para catalisar o SL trans-splicing, sendo composto por pequenas partículas ribonucleoproteicas nucleares (U1, U2, U4, U5 e U6 snRNPs), formadas por snRNAs e fatores proteicos específicos associados. O spliceossomo requer rearranjos para assumir sua conformação catalítica, após montagem sobre o pré-mRNA. A proteína U5-200K, componente da partícula U5 snRNP em T. brucei, apresenta dois domínios helicase DEAD/DEAH box e um domínio Sec63 conservados. A região C-terminal desta proteína não conserva outro domínio Sec63, como em leveduras e mamíferos, e sua função ainda não foi identificada. Em levedura, o domínio Sec63 do cassete N-terminal de Brr2 é parte integral do sítio ativo, possibilitando a desestruturação do duplex U4/U6 durante a ativação catalítica do spliceossomo. Este projeto visa à amplificação da ORF de U5-200k do DNA genômico de T. brucei, clonagem molecular em vetor pC-PTP-neo, que permite a expressão da proteína de interesse fusionada a tag contendo epítopos em tandem (PTP; P, dois domínios proteína A; T, um sítio de TEV protease; P, e um domínio de Proteína C). Intenciona-se obter diferentes construções, a contar com a U5-200K nativa e mutantes, neste último caso, pretende-se obter proteínas que não possuam cada domínio específico. Após estabelecimento da de linhagens T. brucei expressando U5-200K-PTP e de produtos mutantes, o principal objeto do presente projeto visa estudar a influência de U5-200K e seus domínios na formação do U5 snRNP ou eventualmente de outros complexos participantes da reação de splicing. (AU)