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Análise do conteúdo de DNA e RNA da glicoproteína do vírus da raiva em células S2MtRVGP, selecionadas por metodologia imunomagnética

Processo: 14/03415-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Vigência (Início): 01 de abril de 2014
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2015
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Pesquisador responsável:Renato Mancini Astray
Beneficiário:Roselane Paiva Gomes
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:12/24647-0 - Purificação e caracterização da glicoproteína do vírus da raiva produzida pelos sistemas S2 (Drosophila melanogaster) e Semliki Forest Vírus recombinante, AP.R
Assunto(s):Biotecnologia   Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR)   Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR)

Resumo

O projeto de treinamento técnico tem por objetivo geral avaliar a capacidade da metodologia de seleção imunomagnética em melhorar a expressão da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em células de inseto Drosophila melanogaster S2, transfectadas com o gene da RVGP. A seleção imunomagnética é realizada pela marcação da RVGP expressa na superfície celular com anticorpos específicos e posterior reconhecimento com esferas magnéticas sensibilizadas com anticorpos anti-anticorpos, de forma que as células contendo esferas em sua superfície são retidas em uma superfície magnetizada e posteriormente eluídas em meio de cultura. A avaliação da metodologia será realizada através da análise dos números de cópias do DNA e do RNA mensageiro da RVGP e da quantidade de RVGP, presentes em cada célula das populações selecionada e não selecionada. As técnicas necessárias para o estudo envolvem a extração, purificação e quantificação de ácidos nucléicos e proteína. A extração dos ácidos nucleicos será feita por lise celular química e purificação por meio de colunas comerciais, seguida da quantificação por espectrofotometria ou fluorimetria para determinar a quantidade de material extraído. Quantidades padronizadas de RNA serão inseridas em reações de transcrição reversa para a obtenção de cDNA. As amostras serão quantificadas em PCR quantitativa, utilizando a estratégia de quantificação relativa, comparando as populações de células selecionadas e não selecionadas por técnica imunomagnética. A RVGP produzida será quantificada através da técnica de ELISA. As atividades de manipulação de RNA e da realização de análises reprodutivas e validadas em PCR quantitativa constituem aprendizado valioso para a formação técnica da estudante.