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Uso de um modulador específico da atividade de Src -PP1- como estratégia de diferenciação de osteoblastos

Processo: 14/04305-3
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de maio de 2014
Vigência (Término): 30 de abril de 2016
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Odontologia - Cirurgia Buco-maxilo-facial
Pesquisador responsável:Willian Fernando Zambuzzi
Beneficiário:Ana Clara Denadai
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IBB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
Assunto(s):Bioquímica   Transdução de sinais   Diferenciação celular   Osteoblastos   Fosfatase alcalina

Resumo

O estudo de diferentes condições fisiológicas, normais ou patológicas, em tecidos mineralizados tem ganho destaque nos últimos anos, devido, principalmente, ao aumento da expectativa de vida. Neste contexto, doenças como a osteoporose, têm despertado maior interesse em diferentes grupos de pesquisa. Nosso grupo tem trabalhado com mecanismos de transdução de sinais envolvidos com a diferenciação de osteoblastos e verificamos que a modulação da atividade de Src pela LMWPTP (Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase) é uma condição necessária para este evento. Neste caso, durante a diferenciação osteoblástica, Src encontrava-se inibida (desfosforilada no resíduo Y416). Baseado nestes achados, aventamos a hipótese de que inibição exógena de Src estimularia a diferenciação dos osteoblastos. Desta maneira, decidimos propor neste projeto o uso de um inibidor específico de Src (PP1) como estratégia de diferenciação de pré-osteoblastos (MC3T3-E1). Inicialmente, faremos uma curva dose-resposta, avaliando seu efeito citotóxico, afim de escolhermos uma concentração subtóxica. Em ensaios de diferenciação celular, pre-osteoblastos serão cultivados em placas de 6 poços e mantidos na presença do inibidor por 3, 7 e 14 dias. Utilizaremos como controle do experimento um grupo sem tratamento e outro onde as células serão tratadas com moléculas clássicas de diferenciação celular: ácido ascórbico (50 ug/mL) e b-glicerofosfato (10 mM). A atividade de fosfatase alcalina será monitorada durante os períodos a fim de verificarmos mecanismos de diferenciação celular. Além disso, faremos um acompanhamento do perfil de fosforilação de Src em ambos resíduos (Y416 e Y527) a fim de predizer quanto sua atividade - para tanto, utilizaremos western blotting como metodologia. Os resultados serão devidamente trabalhados com métodos estatísticos.