Osteogênese in vitro e in vivo a partir de células-tronco da polpa dentária humana: papel das metaloproteinases de matriz e seus inibidores

• Processo: 14/01395-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2014
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2016
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Odontologia
• Pesquisador responsável: Katiúcia Batista da Silva Paiva
• Beneficiário: Letícia Miquelitto Gasparoni
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 10/08918-9 - Terapia gênica associada à bioengenharia tecidual óssea: superexpressão e inibição de metaloproteinases de matriz (MMPs) e seus inibidores (TIMs e RECK) em osteoblastos originados de células-tronco mesenquimais humanas semeados em colágeno-quitosana, AP.JP
• Assunto(s): Biologia molecular MMP
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Bioengenharia Óssea | Biomaterial colágeno-quitosana | Células-tronco da polpa dentária humana | Mmp | Reck | Timp | Biologia Molecular

Resumo

As DPSCs foram isoladas a partir de polpas dentárias saudáveis (n=3) e expandidas, para a (I) caracterização do fenótipo mesenquimal (imunofenotipagem, curva de proliferação e tempo de dobramento populacional, viabilidade celular, senescência, formação de colônia, microscopia eletrônica de transmissão/MET e indução da diferenciação adipogênica), (II) perfil de expressão do Colágeno tipo I/Col I, MMPs/TIMPs/RECK por imunofluorescência (IF) nas DPSCs indiferenciadas, (III) caracterização dos biomarcadores da osteogênese após a indução da diferenciação in vitro por 35 dias (MET, quantificação da atividade da fosfatase alcalina, expressão gênica e IF de Col I, expressão gênica de RUNX2, BSP, ATF-4, FRA-1, SOST, ORP150, Conexina 43 e E11/gp38 e formação de nódulos de mineralização por alizarina vermelha); (IV) perfil de expressão gênica e protéica das MMPs/TIMPs/RECK após a indução da diferenciação in vitro por 35 dias; (V) perfil de expressão protéica das MMP-2 e MMP-14 após a indução da diferenciação in vitro por 35 dias por western blot; (VI) avaliação da interação das DPSCs semeadas sobre colágeno e blenda de colágeno/quitosana e da osteogênese após a indução da diferenciação in vitro por 35 dias por microscopia eletrônica de varredura; (VII) avaliação da formação ectópica óssea das DPSCs semeadas sobre a blenda de colágeno/quitosana, pré-diferenciadas por 7 dias in vitro e implantadas em subcutâneo de camundongos nude por 42dias por análise histológica; e (VIII) avaliação imunohistoquímica das TIMPs durante a formação óssea ectópica in vivo. As DPSCs apresentaram positividade para os marcadores de superfície celular característicos de MSCs, alta taxa proliferativa, metabolismo celular adequado ao seu status celular, potencial clonogênico em baixa densidade, citoplasma contendo mitocôndrias alongadas e retículo endoplasmático rugoso bem como núcleos definidos e capacidade de diferenciação adipogênica, mas com algumas diferenças. Col I, algumas MMPs, todas as TIMPs e RECK foram expressos nas DPSCs indiferenciadas. Durante a indução da osteogênese, verificamos que houve pico da atividade da fosfatase alcalina em 14 dias bem como o início de formação de nódulos de mineralização entre 7-21 dias. Já os níveis de transcritos para os genes relacionados ao comprometimento com a linhagem osteoblástica (RUNX2), e na transição osteoblasto/osteócito foram bastante variados entre as DPSCs de pacientes diferentes, potencialmente refletindo diferentes estágios de diferenciação ou composição de células-tronco já que trabalhamos com populações heterogênias de DPSCs. Da mesma maneira, houve uma variação na expressão gênica das MMPs/Inibidores em função da DPSC avaliada. De forma geral, a maioria das MMPs/Inibidores foram reguladas positivamente durante a indução da diferenciação osteoblástica em relação as DPSCs indiferenciadas e as MMPs -9, -19 e -25 não foram expressas. Houve uma relação entre o perfil dos marcadores de diferenciação osteoblástica com a expressão das MMPs/Inibidores, onde verificamos 3 perfis distintos. Os níveis protéicos das MMPs -2 e -14 foram mais elevados dos que das DPSCs de 28 a 35 dias, períodos relacionados à fase de mineralização. A análise histológica da formação óssea ectópica revelou, os grupos experimentais, a blenda associada as DPSCs pré-diferenciadas pode ser degradada e remodelada de maneira tempo-dependente e é capaz de formar uma matriz osteóide de 28 a 42 dias. Pela análise imunohistoquímica, as TIMPs foram amplamente expressas por células mesenquimais. Assim, sugerimos que as MMPs/TIMPs/RECK podem desempenhar importantes funções para a manutenção do estado indiferenciado das DPSCs bem como podem atuar em diferentes estágios da diferenciação osteblástica e na mineralização in vitro. Além disso, sugerimos que a blenda de semeada com DPSCs pode estimular a formação óssea ectópica, portanto, sendo osteogênico e que as TIMPs pode participar ativamente nos processos de remodelamento tecidual envolvidos.

Publicações acadêmicas

(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)

GASPARONI, Letícia Miquelitto. Osteogênese in vitro a partir de células-tronco da polpa dentária humana: papel das metaloproteinases de matriz e seus inibidores.. 2016. Dissertação de Mestrado - Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas (ICB/SDI) São Paulo.