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Caracterização bioquímica e funcional da adesina XadA3 de Xylella fastidiosa

Processo: 14/03617-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de maio de 2014
Vigência (Término): 31 de julho de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Bioquímica de Microorganismos
Pesquisador responsável:Aline Maria da Silva
Beneficiário:Ana Paula Silva de Souza
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Xylella fastidiosa   Adesão celular   Biofilmes

Resumo

O fitopatógeno Xylella fastidiosa, responsável por graves doenças em citros, videiras, cafeeiros e amendoeiras, entre outras plantas, apresenta, em sua superfície, diversas adesinas fimbriais e não-fimbriais importantes para colonização eficiente de insetos vetores e plantas hospedeiras. Entre as adesinas codificadas no genoma de X. fastidiosa (cepa 9a5c, isolada de citros ou cepa Temecula, isolada de videiras) estão três adesinas classificadas como auto-transportadores triméricos (XadA1, Hsf/XadA2 e Hsf/XadA3). O envolvimento de XadA1 e XadA2 na formação do biofilme e alguns aspectos da regulação da expressão destas proteínas já foram parcialmente estudados em trabalhos anteriores, porém, a função e as propriedades bioquímicas de XadA3 são ainda desconhecidas. Neste cenário, iniciamos o projeto de caracterização bioquímica e funcional da adesina XadA3 de Xylella fastidiosa (Bolsa de Mestrado FAPESP/Processo 2011/15217-0). Os resultados já obtidos indicam que a adesina XadA3 não é secretada e está mais expressa no biofilme do que nas células em suspensão, dados que corroboram com o esperado para proteínas autotransportadoras triméricas, as quais estão localizadas na membrana externa de bactérias Gram-negativas. O mutante de XadA3 (DxadA3) que foi obtido teve sua capacidade de agregação celular e formação de biofilme diminuída em relação à cepa selvagem Temecula. Ensaios realizados em colaboração com o grupo do Prof. Steve Lindow mostraram que o mutante delta-xadA3 é deficiente na transmissão pelo inseto vetor para plantas e exibe um fenótipo de hipervirulência em ensaios de infecção de videiras. O conjunto destes dados revela a importância desta adesina para formação do biofilme e adesão célula-célula em X. fastidiosa in vitro, no inseto vetor e nos vasos do xilema. No presente projeto de Doutorado Direto iremos aprofundar a caracterização bioquímica e funcional da proteína XadA3 de X. fastidiosa através de análises adicionais do fenótipo do mutante delta-xadA3 quanto a sua capacidade de adesão ao substrato, formação de biofilme e motilidade sob condições de fluxo. O efeito da deleção de xadA3 no nível de expressão de outras adesinas e de outros genes será avaliado e comparado ao efeito da deleção dos genes das adesinas XadA1 e XadA2. A regulação da expressão de xadA3 será investigada através da análise do nível de expressão de seu transcrito em linhagens defeituosas em vias de sinalização. Também iremos iniciar estudos que visam desvendar os mecanismos de adesão de XadA3, através da utilização do anticorpo anti-XadA3 como um potencial interferente na adesão intercelular e à superfície. Outra abordagem para investigar o mecanismo de adesão de XadA3, consistirá na expressão desta proteína na membrana externa de E. coli na expectativa que resulte na aglutinação dessas células e/ou em sua maior adesão à superfície (vidro ou plástico). O sucesso deste ensaio de ganho de função possibilitará a análise da capacidade de adesão de variantes polimórficos de XadA3, que serão selecionados a partir da análise comparativa das sequências de XadA3 recuperadas do genoma já sequenciado de 18 cepas isoladas de diferentes hospedeiros, como citros, videira, ameixeira, hibisco e cafeeiro. (AU)

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