Desenvolvimento de um vetor com genes CTV (Citrus tristeza virus) para o controle do Huanglongbing no Brasil

• Processo: 14/04482-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Pesquisa
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2014
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2015
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
• Pesquisador responsável: Diva Do Carmo Teixeira
• Beneficiário: Diva Do Carmo Teixeira
• Pesquisador Anfitrião: William O. Dawson
• Instituição Sede: Fundo de Defesa da Citricultura (FUNDECITRUS). Araraquara , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of Florida, Gainesville (UF), Estados Unidos
• Assunto(s): Biologia molecular Citrus Vetores de doenças
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Citros | Citrus tristeza virus | Greening | Huanglongbing | Vetor CTV | Biologia Molecular

Resumo

A capacidade de expressar genes estranhos ou silenciar genes endógenos em plantas revolucionou tanto a biologia vegetal básica como a aplicada. Os sistemas de expressão à base de vírus, em que o mRNA é grandemente amplificado por meio da replicação viral, pode produzir níveis muito elevados de proteínas ou peptídeos em folhas e outros tecidos. O vírus da tristeza dos citros (CTV) é composto por duas proteínas do capsideo e de uma de cadeia simples de RNA com cerca de 20 kb, contendo 12 "ORFs" e duas regiões não traduzidas denominadas "UTRs". A maioria dos isolados são populações de "diferentes" genótipos, geralmente com a predominância de uma ou mais sequencias. Reproduzir fielmente todos os genes do CTV através de manipulações de DNA recombinante é um grande desafio. Tal sistema genético tem sido desenvolvido e permite a replicação em protoplastos. O desenvolvimento de um clone de cDNA "full-lenght" a partir do genoma do isolado T36 (CTV-T36) foi relatado em 1999. Subsequentemente, o desenvolvimento de um sistema para inocular plantas cítricas com vírions de CTV recombinante (CTVr) permitiu produzir a primeira "cultura pura" de CTV em plantas. Genomas virais são eficientemente liberados nas células vegetais através da infiltração de tecidos com culturas de Agrobacterium tumefaciens carregando plasmídeos binários com cDNA completo de genomas virais. No entanto, tentativas para agroinocular "alemow" ou "mexican lime" com tais plasmídeos carregando um clone de cDNA do CTV-T36 foram infrutíferas. Assim, um sistema genético baseado na agroinfiltração de N. Benthamiana como hospedeira intermediária para a produção de partículas virais para infectar plantas de citros por inoculação mecânica foi desenvolvido e tais plantas foram eficientemente infectadas com purificados obtidos de folhas de N. benthamiana agroinfiltrada com o clone de cDNA-T36. A estratégia de maior sucesso na obtenção de vetor CTV para a expressão transiente de um gene em planta, foi aquela onde GPF e um elemento controlador foram adicionados entre os genes da capa proteica. Huanglongbing (HLB) é um dos fatores limitantes na citricultura de muitos países e é causado pela bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) que tem o psilideo Diaphorina citri como inseto vetor. Até o momento, os métodos de controle do HLB consistem na redução da população de psilideos através de inseticidas e na identificação e eliminação das plantas infectadas, o que tem um alto custo, dificultando enormemente o controle dessa doenca. Disso resulta que, mesmo a longo prazo, a estratégia mais econômica e sustentável para o manejo do HLB seja a produção de árvores resistentes. Inicialmente, o vetor CTV foi muito usado para escrinar potenciais genes que poderiam conferir resistência ao Las ou repelir o inseto, com a ideia de se inserir tais genes nas plantas de citros, resultando em plantas transgênicas. Entretanto, os graves e crescentes efeitos devastadores que o HLB vem provocando fizeram surgir uma nova abordagem no uso do vetor CTV em campo, expressando genes anti-Las, como uma alternativa mais rápida para o controle do HLB quando comparada aquela que visa obter plantas transgênicas. A grande vantagem de um vetor CTV é que o mesmo pode ser transmitido por enxertia a variedades de citros, evitando-se as características juvenis e as avaliações em campo envolvidos nos processos de obtenção de plantas transgênicas. Este trabalho visa a obtenção de um vetor CTV de origem brasileira, para que possa ser utilizado na expressão de genes em plantas de citros que produzam resistência ao HLB. Seu desenvolvimento permitirá não só a transferência de tecnologia ao Brasil na construção de vetores CTV mas também a abertura de novas possibilidades de combate ao HLB. Possivelmente, o sucesso na solução de problemas da citricultura em geral virá não apenas da utilização de uma única estratégia, mas sim da combinação de várias tecnologias, que só com o avanço dos trabalhos de pesquisa, se tornarão viáveis. (AU)