Resumo
A complexidade e variedade de alvos fisiológicos com as quais as toxinas de peçonha de serpentes interagem fazem destas, importantes candidatas para modelos no desenvolvimento de novos fármacos e ferramentas biológicas. As peçonhas de serpentes da família Viperidae são ricas fontes de enzimas proteolíticas que exercem diversas atividades biológicas na presa ou vítima, como ativação do sistema complemento e inflamação, alterações na diferenciação celular, interações com o sistema hemostático, entre outros. As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs - Snake Venom Serine Protease) atuam principalmente sobre proteínas plasmáticas, gerando uma diversidade de alterações fisiológicas com efeitos sobre a agregação plaquetária, coagulação sanguínea, fibrinólise, pressão sanguínea, sistema complemento e sistema nervoso. No entanto, a complexidade dos mecanismos pelos quais as SVSPs afetam a homeostasia da vítima não foi, até o momento, completamente esclarecida. Diante disso, o presente projeto tem por objetivo buscar novas perspectivas sobre a funcionalidade de uma SVSP de Crotalus durissus collilineatus, denominada collineina-1, com o intuito de ampliar os possíveis campos de aplicação dessa classe de toxinas. Dentro desse contexto, neste projeto é a proposta a investigação da ação da collineina-1, nas formas nativa, recombinante e mutante, sobre diferentes canais iônicos dependentes de voltagem. A collineina-1 nativa será purificada da peçonha por um método cromatográfico previamente descrito e a enzima recombinante será expressa em Pichia pastoris nas formas cataliticamente ativa e inativa (apresentando uma mutação na His43 da tríade catalítica por uma Arg43), de acordo com protocolo previamente padronizado. As toxinas serão testadas quanto a sua ação sobre diferentes canais iônicos dependentes de voltagem (Kv e Nav) expressos em oócitos de Xenopus laevis por ensaios de eletrofisiologia. Os mecanismos pelos quais a collineina-1 atua sobre os canais iônicos dependente de voltagem serão então investigados por ensaios de eletrofisiologia utilizando a toxina cataliticamente inativa e por testes de reversibilidade do bloqueio ou modulação do canal. Os canais iônicos desempenham importantes funções celulares como excitação de nervos e células musculares, regulação da pressão sanguínea, mobilidade e capacitação de espermatozoides e modulação da proliferação de células tumorais. Apesar da importância desses canais, são poucas as toxinas de serpentes estudadas quanto à ação sobre canais iônicos, o que reforça a importância do estudo proposto na busca de novas toxinas moduladoras ou bloqueadoras desses canais com potencial para serem aplicadas em diversas áreas da ciência e/ou saúde.
|