Estudo funcional de mutações no gene CDH1 implicadas em fissuras labiopalatinas por meio da técnica CRISPR-Cas9 de edição de genoma em zebrafish

• Processo: 14/19269-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
• Data de Início da vigência: 10 de novembro de 2014
• Data de Término da vigência: 17 de março de 2015
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
• Pesquisador responsável: Maria Rita dos Santos e Passos Bueno
• Beneficiário: Luciano Abreu Brito
• Supervisor: Eric Chien-Wei Liao
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Harvard University, Boston, Estados Unidos
• Vinculado à bolsa: 11/23416-2 - Análise genômica para a compreensão dos mecanismos genéticos etiológicos das fissuras labiopalatinas na população brasileira, BP.DR
• Assunto(s): Embriogênese Fenda labial Exoma Peixe-zebra Proteínas Cdh1 Mutações induzidas RNA guia Sistemas CRISPR-Cas CRISPR-Cas9
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cdh1 | CRISPR-Cas9 | Fissura labiopalatina | Sequenciamento de exoma | Variantes raras | Zebrafish | Doencas Complexas

Resumo

A caderina epitelial, codificada pelo gene CDH1, é uma molécula chave para estabelecer as junções aderentes das células epiteliais, e exerce também um importante papel na transição epitélio-mesênquima, mecanismo central na embiogênese do lábio e palato. Nós identificamos, por sequenciamento de exoma, 2 mutações missense no CDH1 (c.G760A e c.G2351A) segregando com fissura labial com ou sem fissura de palato (FLP NS) em 3 famílias brasileiras. Essas mutações nunca foram descritas e estão ausentes em 831 controles brasileiros. Análises in silico indicaram que ambas prejudicam a função da proteína; entretanto, a patogenicidade delas precisa ser confirmada em um estudo funcional. O nosso objetivo principal a ser alcançado com a colaboração do Dr. Liao, no Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, é testar a relevância do CDH1 na etiologia das FLP NS. Para isso, analisaremos o efeito funcional das duas mutações previamente mencionadas utilizando zebrafish como modelo. Muitos estudos tem mostrado que o zebrafish é um ótimo modelo para estudar genes humanos importantes para o desenvolvimento craniofacial, particularmente aqueles relacionados ao desenvolvimento de ossos que constituirão a mandíbula, maxila e palato. Nós estamos planejando introduzir 2 mutações no CDH1 que inativem completamente o gene (knockout gênico), bem como as 2 mutações missense identificadas. As mutações serão criadas por meio da técnica de edição de genoma mediada por CRISPR/Cas9. Esta tecnologia tem sido considerada extremamente promissora para o estudo das funções gênicas e do efeito de mutações específicas no fenótipo, e baseia-se na co-injeção da endonuclease Cas9 e de um single-guide RNA (sgRNA), responsável por guiar a Cas9 até um sítio alvo do genoma, reconhecido por complementaridade de sequências.Para atingir estes objetivos, organizamos os experimentos em 2 estágios. No primeiro, irei desenhar os sgRNAs (ainda no Brasil, no laboratório da Dra. Passos-Bueno), de modo que as sondas estejam prontas quando eu chegar ao laboratório do Dr. Liao, onde passarei 3-4 meses. Durante este período, treinarei as as injeções em embriões de zebrafish, e então introduzirei o sistema CRISPR/Cas9 para as nossas mutações desejadas. Isso irá gerar a geração F0, a qual terá alguns indivíduos mosaicos para cada uma das 4 mutações. Esses peixes levarão 3 meses para crescer e atingir a maturidade sexual; durante este período, eu retornarei ao Brasil. O nosso interesse será a geração F1, que esperamos que contenha indivíduos heterozigotos não-mosaicos (com mutação em todas as células do corpo). A geração F1 será obtida pelo cruzamento dos mosaicos F0 com peixes selvagens, assim que F0 atingir a maturidade sexual. Quando obtivermos a F1, esta será triada para a presença das mutações. No caso destas serem identificadas, procederemos para a caracterização fenotípica e análise morfológica dos mutantes. Para estas análises finais, está previsto o meu retorno para o laboratório do Dr. Liao para um período de 2 meses.Este projeto BEPE refere-se aos primeiros 3-4 meses de experimentos. Durante o período de crescimento e reprodução da geração F0 e crescimento da F1 (de aproximadamente 5 meses), eu retornarei ao Brasil para terminar as últimas análises do meu projeto principal e escrever a tese. Tão logo a geração F1 estiver crescida e os mutantes forem obtidos, eu retornarei ao laboratório do Dr. Liao para a caracterização de F1. Para este segundo estágio, conforme sugerido pela FAPESP, aplicarei para um segundo BEPE ou então usarei outros recursos para concluir esta etapa. É meu objetivo terminar estas análises ainda durante meu doutorado, e possivelmente continuar durante um pós-doutorado. A Dra. Passos-Bueno e o Dr. Liao estão planejando uma colaboração de longo prazo para o estudo funcional de variantes candidatas a FLP NS em zebrafish, no sentido de testar as variantes identificadas no laboratório da Dra. Passos-Bueno no laboratório do Dr. Liao. (AU)