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Caracterização do mecanismo pelo qual a microbiota intestinal, incluindo Proteus Mirabilis, ativa o inflamassoma NLRP3

Processo: 14/20384-0
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de março de 2015
Vigência (Término): 29 de fevereiro de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Imunologia - Imunologia Aplicada
Pesquisador responsável:Vera Lucia Garcia Calich
Beneficiário:Claudia Feriotti
Supervisor no Exterior: Gabriel Nuñez
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : University of Michigan, Estados Unidos  
Vinculado à bolsa:13/02396-9 - O papel do inflamassoma NLRP3 na paracoccidioidomicose pulmonar, BP.PD
Assunto(s):Proteus mirabilis

Resumo

Caracterização do mecanismo pelo qual a microbiota intestinal incluindo Proteus mirabilis ativa o inflamassoma NLRP3.P. mirabilis é um membro da família Enterobacteriaceae, e é um robusto indutor da secreção IL-1 beta via NLRP3 e esta bactéria residente induz ativação de NLRP3 pela produção de hemolisina A (hmpA). Baseado em estudos usando camundongos convencionais, livre de germes "germ free", e tratados com antibiótico, a microbiota intestinal induz IL-1 beta e isto é mediado pelo NLRP3 inflamassoma. Com este objetivo, nós propomos uma serie de estudos para compreender melhor o mecanismo pelo qual a microbiota e a bactéria residente P. mirabilis, induz robusta secreção de IL-1 beta via NLRP3. Nós iremos começar pela estimulação de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos triplo-deficientes para os genes MyD88/TRIF e RIP2, as proteínas adaptadoras requeridas para a sinalização via TLR e NOD1/2, respectivamente ,com conteúdo fecal ou P. mirabilis, e a expressão de pro-IL-1beta e IL-1 beta madura serão determinadas e analisadas por qPCR e immunoblotting. Para determinar se a hmpA é requerida para a ativação da caspase-1, macrófagos serão estimulados com as cepas selvagens e deficientes para hmpA de P. mirabilis e será realizado o immunoblotting dos extratos celulares com anticorpo anti-caspase-1 (sub unidade p20). Para determinar se a hmpA medeia o fluxo de potássio (K+), macrófagos serão estimulados com as cepas selvagens e deficientes de hmpA de P. mirabilis e serão dosados os níveis intracelulares de K+. Para determinar se NLRP3 e oligômeros de ASC são induzidos em resposta à microbiota ou P. mirabilis, nós iremos usar cromatografia de exclusão por tamanho, para fracionar os extratos dos macrófagos primados estimulados com conteúdo fecal ou P. mirabilis, e as frações serão corridas em SDS-PAGE e immunoblot com anticorpos anti-NLRP3, anti-ASC e anti-caspase-1. Para determinar se a microbiota ou P. mirabilis induzem a formação de ciscos "specks" e oligomerização de ASC, nós iremos incubar macrófagos com conteúdo fecal ou P. mirabilis, e a formação de ciscos de ASC e oligômeros de ASC serão detectadas por microscopia fluorescente. Nós iremos tratar os macrófagos com o inibidor celular permeável de pancaspase zVAD-FMk para verificar se NLRP3 e ASC requerem a ativação da caspase-1. Experimentos in vivo serão realizados, para testar se a via de sinalização TLR/NOD é requerida para a secreção de IL-1 beta no intestino através do uso de camundongos triplo deficientes para os genes MyD88/TRI/RIP2 e camundongos livre de germes "Germ-free" os quais serão colonizados com cepas de P. mirabilis deficientes de hmpA e tratados com dextran sulfato de sódio (DSS) na água de beber, e determinar a expressão mRNA de NLRP3 e IL-1beta por qPCR e IL-1beta por ELISA. Nós esperamos que a sinalização via TLR e/ou Nod1/Nod2 ira mediar a ativação do inflamassoma NLRP3. A metodologia, materiais e aspectos mecanicistas estão disponíveis, desta forma nós não teremos problemas com os experimentos propostos neste projeto. (AU)