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Estudo conformacional do receptor AT1 de Angiotensina II sob tensão de cisalhamento por dinâmica molecular e mutação sítio dirigida

Processo: 14/13940-4
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de outubro de 2014
Vigência (Término): 08 de agosto de 2016
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina
Convênio/Acordo: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Pesquisador responsável:José Eduardo Krieger
Beneficiário:Matheus Malta de Sá
Instituição-sede: Instituto do Coração Professor Euryclides de Jesus Zerbini (INCOR). Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP (HCFMUSP). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Cardiologia   Simulação de dinâmica molecular   Modelagem molecular   Angiotensinas

Resumo

O receptor AT1 pertence à família dos receptores acoplados à proteína G. A ligação da angiotensina II leva à ativação da proteína G heterodimérica e consequente ativação da fosfolipase C e da proteína quinase C dependente de cálcio (PKC). O receptor é então fosforilado pela ²-arrestina e internalizado. Estudos mostraram que a ²-arrestina também gera segundos mensageiros que ativam outras cascatas de sinalização. Além disso, acredita-se que a ativação dessa via possa acontecer independentemente da proteína G, por moléculas chamadas agonistas enviesados. Essa seletividade na ativação do receptor AT1 pode levar à diminuição da pressão arterial por não ativar a via de proteína G e, ao mesmo tempo, não bloquear os efeitos benéficos da ²-arrestina (sobrevivência e renovação celular). O receptor AT1 também pode ser ativado por forças mecânicas como estiramento e cisalhamento. Recentemente demonstrou-se que o cisalhamento ativa a via dependente e independente de proteína G do AT1, sem a necessidade de um ligante. Como a atividade de uma proteína está ligada à sua conformação, a habilidade do AT1 em gerar diferentes respostas farmacológicas levanta a hipótese da existência de diferentes conformações ativas do receptor. Neste trabalho propomos estudar mudanças conformacionais e identificar os resíduos de aminoácidos do receptor AT1 que conferem responsividade à força de cisalhamento por meio de simulações computacionais de dinâmica molecular (DM) e validação dos resultados por analise funcional em modelo celular expressando o AT1 com as mutações pontuais candidatas. As técnicas computacionais permitem estudar detalhadamente mudanças que acontecem a nível atômico a baixo custo quando comparadas a técnicas experimentais de resolução de estrutura de proteínas. As mutações pontuais serão produzidas com o kit Stratagene QuickChange® Site-Directed Mutagenesis e a avaliação da atividade do receptor será detectada medindo-se a interação da ²-arrestina com o receptor AT1 ativado através de uma reação de quimiluminescência usando um fragmento complementar da enzima ²-gal. Alternativamente, pretende-se estudar as mudanças conformacionais do receptor AT1 na presença de agonistas enviesados. Com isso, espera-se obter detalhamento sobre os estados conformacionais do AT1 que ajudem a elucidar o mecanismo de ação enviesado desse receptor. (AU)

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