Análise funcional e estrutural de transportador ABC de glutamina em Mycobacterium tuberculosis

• Processo: 14/19570-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 12 de janeiro de 2015
• Data de Término da vigência: 11 de abril de 2015
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Andrea Balan Fernandes
• Beneficiário: Ana Leticia Gori Lusa
• Supervisor: Isabel Moraes
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Diamond Light Source, Inglaterra
• Vinculado à bolsa: 12/23469-1 - Expressão e Purificação de Transportadores do Tipo ABC de Mycobacterium tuberculosis para Estudos Funcionais e Estruturais - Uma Plataforma para Produção de Proteínas de Membrana, BP.PD
• Assunto(s): Mycobacterium tuberculosis Glutamina
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: glutamina | Mycobacterium tuberculosis | proteína de membrana | Transportador ABC | Estrutura de proteínas

Resumo

As proteínas da membrana correspondem a 25% a 30% de todas as sequências transcritas dos genomas conhecidos e executam uma variedade de funções essenciais no metabolismo celular. Um progresso substancial foi feito na luta para a expressão, purificação e determinação das estruturas cristalinas de proteínas de membrana. Além disso, eles representam 50% dos alvos da indústria farmacêutica. Em M. tuberculosis, o agente causador da tuberculose, os tranportadores da família de cassete de ligação a ATP (ABC) de proteínas de membrana está envolvida no transporte de drogas e de resistência que permite o desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas (MDR) e fármaco-resistente (cepas XDR). Portanto, o entendimento de mecanismos de efluxo é cada vez mais importante na área de descoberta de medicamentos da tuberculose. No projeto principal pretendemos produzir vários transportadores ABC de M. tuberculosis para estudos funcionais e estruturais. Após uma série de experimentos envolvendo ensaios de clonagem, expressão e purificação de proteínas que formam os complexos, selecionamos três transportadores para a caracterização detalhada. Os genes Rv2563 e Rv2564 codificam uma permease e uma ATPase do transportador de glutamina, aminoácido que é essencial na via do nitrogênio. O Rv2563 foi previamente expressa e cristalizado em ausência da ATPase e cristais difractaram a 7 Å de resolução. No entanto, a fim de obter os esforços dos transportadores completos foram feitos para expressar e purificar a ATPase e o complexo juntos. No momento em que o complexo foi produzido e a análise preliminar revelou que este é estável com em detergente DDM. Nesse sentido, os objetivos desta proposta são expressar e purificar o complexo em larga escala para ensaios de cristalização e experimentos de difração usando a linha de luz microfocus do Diamond Light Source. Além disso, iremos expressar e tentar obter dados estruturais do domínio periplasmático da permease, que será importante para o futuro faseamento e determinação da estrutura de cristal do complexo completo. Estes experimentos serão realizados no Laboratório de proteína de membrana no Diamond Light Source sob a supervisão de nosso colaborador Dr. Isabel de Moraes. (AU)