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Mecanismos de sinalização para o processo de exocitose em células beta pancreáticas

Processo: 15/01926-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Apoio a Jovens Pesquisadores
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2014
Vigência (Término): 07 de junho de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Fisiologia - Fisiologia de Órgãos e Sistemas
Pesquisador responsável:Eduardo Rebelato Lopes de Oliveira
Beneficiário:Eduardo Rebelato Lopes de Oliveira
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:14/14826-0 - Mecanismos de sinalização para o processo de exocitose em células beta pancreáticas, AP.JP
Assunto(s):Exocitose   Células secretoras de insulina   Membrana plasmática

Resumo

O processo de secreção de insulina tem como sua etapa final a exocitose dos grânulos insulínicos, sendo composta pelo recrutamento, atracamento e fusão de grânulos à membrana plasmática. Neste projeto, pretendemos estudar alguns dos mecanismos responsáveis pela manutenção do constante recrutamento e atracamento dos grânulos, baseado em sinais intracelulares decorrentes da estimulação da secreção de insulina pela glicose (GSIS). Uma das hipóteses a ser investigada é a de que a alteração para um estado redox mais reduzido nas adjacências da membrana plasmática seja importante para a liberação das proteínas de atracamento, as SNAREs, após eventos de fusão, isso devido à necessidade de proteínas com atividade de ATPase para esse processo, as quais são inativadas por oxidação. Assim, no intuito de observar o comportamento redox na região subplasmalema, combinaremos a análise do estado redox por sondas baseadas em proteínas quiméricas fluorescentes com a técnica de microscopia de campo evanescente (TIRF - Total Internal Reflection Fluorescence), que nos permite direcionar e isolar nossas análises para essa área adjacente à membrana plasmática, dando precisão temporal e espacial. Ademais, para avaliar a exocitose será expressa nas células beta pancreáticas uma proteína quimérica fluorescente direcionada para os grânulos insulínicos, que permitirá monitorar seus movimentos e sua fusão à membrana. Acoplando também o controle elétrico da célula ao amplificador de patch-clamp, conseguiremos precisar os estímulos elétricos de despolarização. Ademais, outro mecanismo de sinalização para a exocitose, poderia envolver processos de aquisição de competência secretória de grânulos insulínicos e de sítios de atracamento na membrana plasmática que se encontrem bloqueados. Nesse sentido, uma segunda hipótese a ser investigada é a de que a ativação da via de sinalização mediada pelo AMPc durante a GSIS garanta a aquisição de competência necessária aos grânulos insulínicos e às regiões na membrana plasmática que receberão os novos grânulos competentes. Por meio da expressão das quimeras fluorescentes nos grânulos, associada à microscopia TIRF e à técnica de patch-clamp, compararemos a capacidade de atracamento de novos grânulos à membrana mediada por AMPc, após estímulos de despolarizações. Ademais, a observação de que grânulos previamente atracados à membrana plasmática não são liberados pelo estimulo da glicose, mas sim por um forte estímulo despolarizante, suscita a possibilidade da expressão diferencial dos sensores de cálcio entre os grânulos ou do deslocamento desses de regiões específicas na membrana plasmática onde se concentram os canais para cálcio, os chamados domínios secretórios. Assim, neste projeto objetivamos analisar a participação de sinais intracelulares advindos da glicose como mecanismos para o recrutamento, atracamento e fusão de novos grânulos à membrana plasmática, bem como entender a possível resistência à secreção de grânulos previamente atracados. Dessa forma, buscamos o entendimento dos possíveis fatores que determinam e ordenam a secreção de insulina no âmbito da exocitose.