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Padronização da técnica de Western Blotting para quantificação proteica após superexpressão do gene da enzima PIPKIIa em culturas de células eritroides humanas

Processo: 15/04179-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de abril de 2015
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2015
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina - Anatomia Patológica e Patologia Clínica
Pesquisador responsável:Maria de Fatima Sonati
Beneficiário:Thais Traina Jorge
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Médicas (FCM). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:14/00984-3 - Doenças dos glóbulos vermelhos: fisiopatologia e novas abordagens terapêuticas, AP.TEM
Assunto(s):Células eritroides   Superexpressão gênica   Western blotting   Enzimas

Resumo

O Western Blotting (WB) é uma importante ferramenta de Biologia Molecular para estudo de proteínas, sendo considerada altamente sensível e específica. Quando ligadas a membranas, as proteínas são detectadas, caracterizadas e quantificadas por ensaios imunológicos. O protocolo de WB envolve seleção do método apropriado, do aparato a ser utilizado, das membranas, tampões e condições de transferência. O objetivo do presente projeto é padronizar a técnica de WB para quantificação da proteína PIKIIA e das globinas alfa, beta e gama, após a superexpressão, através da tecnologia da ativação por RNA (RNAa), do gene da enzima PIPKIIA em cultura de células eritróides humanas. Assim sendo, células CD34+ transduzidas por vetores lentivirais serão lisadas e terão suas proteínas extraídas e mensuradas através da técnica de WB a ser padronizada. As análises proteicas, realizadas através desta técnica, terão por finalidade estimar as quantidades relativas da PIPKIIA e das cadeias globínicas, após o procedimento da superexpressão gênica, correlacionando-se os resultados com aqueles obtidos no qPCR. Ao final, esperamos com todos estes experimentos observar uma possível relação entre a PIPKIIA e a produção de globinas em células eritróides, na tentativa de contribuir para a elucidação das funções desta enzima e avaliar o papel desta na regulação (direta ou indireta) dos genes de globinas.