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Sequenciamento completo de plasmídeos carreando genes de resistência a antibióticos em bactérias de interesse e análise do genoma de linhagens de Pseudomonas aeruginosa produtoras de SPM-1 e de KPC-2 por sequenciamento em larga escala

Processo: 15/11728-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de agosto de 2015
Vigência (Término): 06 de abril de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Pesquisador responsável:Ana Lúcia da Costa Darini
Beneficiário:Renata Galetti
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:14/14494-8 - Epidemiologia molecular de bactérias gram-negativas e genética da resistência a antibióticos, AP.TEM
Bolsa(s) vinculada(s):17/26311-3 - Sequenciamento em larga escala de plasmídeos carreando genes de resistência a antibióticos isolados de Enterobacteriaceae isoladas de frangos, BE.EP.PD
Assunto(s):Genomas   Plasmídeos

Resumo

Atualmente, o principal mecanismo de resistência a antibióticos em bactérias gram-negativas é a produção de enzimas que degradam antibióticos, destacando-se as beta-lactamases. A maioria dos genes codificadores de beta-lactamases está inserida em elementos genéticos móveis (MGE- do inglês Mobile Genetic Elements - integrons, transposons e elementos de inserção) inseridos, ou não, em plasmídeos. Atualmente, o sequenciamento completo do genoma e plasmídeo bacteriano permite o conhecimento de todo o seu conteúdo gênico, como elementos genéticos móveis, genes de resistência e genes de virulência carreados por linhagens epidêmicas. O sequenciamento de nova geração ou em larga escala estão disponíveis e permitem o sequenciamento completo e preciso destes genomas a um custo relativamente baixo. Objetivos: Sequenciar e anotar o draft do genoma de duas linhagens de P. aeruginosa, uma carreando o gene blaSPM-1 e outra o gene blaKPC-2; Identificar a possível presença de MGEs, ilhas de virulência e de patogenicidade em cada um desses genomas e potencialmente associadas ao gene blaSPM-1; Identificar provável presença de plasmídeos inseridos no cromossomo dessas linhagens de P. aeruginosa, e/ou analisar a presença de "cicatrizes" que indiquem como e quantas vezes elementos de transposição foram inseridos e/ou excisados no cromossomo bacteriano; Obter a sequência completa de plasmídeos ainda não tipáveis por técnicas convencionais ou de grande interesse epidemiológico que carreiam genes de resistência em bactérias gram-negativas de interesse clínico e/ou veterinário; Comparar os plasmídeos sequenciados por este projeto com os plasmideos depositados em bancos de dados públicos. Materiais e Métodos: Seleção dos genomas e plasmídeos: Será realizado sequenciamento e montagem e anotação do genoma draft de duas linhagens de P. aeruginosa previamente caracterizadas em nosso laboratório, P. aeruginosa HC84 carreando gene blaSPM-1 isolada no Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP) em 2007 e P. aeruginosa BH6 carreando o gene blaKPC-2 isolada em hospital de Belo Horizonte em 2012. Estimamos selecionar para sequenciamento cerca de 4 a 6 plasmídeos não-tiáveis, extraídos de enterobactérias e/ou bacilos gram-negativos não-fermentadores. Também poderão ser selecionados aqueles plasmídeos que carreiam mais de um gene de resistência e aqueles presentes em bactérias epidemiologicamente importantes (clonalidade da bactéria avaliada por MLST e/ou pulsotipo). Preparo do DNA plasmideal e sequenciamento dos plasmídeos: DNA plasmideal será extraído utilizando o PureLinkTM HiPure Plasmid Filter Midiprep (Invitrogen) e experimentos de eletro-transformação e/ou conjugação serão realizados nos isolados selecionados, quando necessário, utilizando técnicas já descritas. O sequenciamento será realizado utilizando a plataforma Illumina MiSeq (Illumina, Inc), utilizando a estratégia de paired-end sequencing (2x300bp). Montagem e anotação dos genomas e plasmídeos: A qualidade do sequenciamento será verificada utilizando o programa FastQC (Babraham Bioinformatics) e a montagem 'de novo' será realizada utilizando o programa Velvet (European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI). A união dos contigs será confirmada por PCR seguido de sequenciamento pelo método de Sanger. Os dados serão então analisados utilizando a ferramenta Prokka e CLC Genomics Workbench (CLCbio, Quiagen), os softwares Artemis Version 8 (Sanger Institute) e Sequin. A confirmação e validação das ORFs serão realizadas utilizando BLASTN e BLASTP. Execução do projeto: A realização das análises de sequenciamento será realizada no Laboratório Especial de Bacteriologia e Epidemiologia Molecular - LEBEM pela pós-doutoranda selecionada. Para o suporte da análise do sequenciamento, teremos como colaboradores a Dra. Alessandra Carattoli e Dr. Alessandro de Mello Varani. (AU)

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
GALETTI, RENATA; ANDRADE, LEONARDO NEVES; VARANI, ALESSANDRO M.; COSTA DARINI, ANA LUCIA. A Phage-Like Plasmid Carrying bla(KPC-2) Gene in Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa. FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, v. 10, MAR 20 2019. Citações Web of Science: 0.
GALETTI, RENATA; CASARIN PENHA FILHO, RAFAEL ANTONIO; FERREIRA, JOSEANE CRISTINA; VARANI, ALESSANDRO M.; COSTA DARINI, ANA LIICIA. Antibiotic resistance and heavy metal tolerance plasmids: the antimicrobial bulletproof properties of Escherichia fergusonii isolated from poultry. INFECTION AND DRUG RESISTANCE, v. 12, p. 1029-1033, 2019. Citações Web of Science: 1.
CACADOR, NATALIA CANDIDO; DA COSTA CAPIZZANI, CAROLINA PAULINO; MONTEIRO MARIN TORRES, LFDIA ALICE GOMES; GALETTI, RENATA; CIOFU, OANA; DA COSTA DARINI, ANA LTICIA; FLEFIBY, NIELS. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa to the chronic phenotype by mutations in the algTmucABD operon in isolates from Brazilian cystic fibrosis patients. PLoS One, v. 13, n. 11 NOV 29 2018. Citações Web of Science: 3.

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