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Avaliação da eficácia do método de sequenciamento de nova geração na análise dos genes MEN1, CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27kip1 e AIP em pacientes com neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1)

Processo: 15/07625-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Vigência (Início): 01 de julho de 2015
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2015
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
Pesquisador responsável:Delmar Muniz Lourenço Jr
Beneficiário:Betsaida Urtremari
Instituição-sede: Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP (HCFMUSP). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:13/19810-2 - Avaliação da eficácia do método de sequenciamento de nova geração na análise dos genes MEN1, CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27Kip1 e AIP em pacientes com neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1), AP.R
Assunto(s):Neoplasia endócrina múltipla tipo 1   Sequenciamento de nova geração   Endocrinologia

Resumo

A neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1) é uma doença genética, de herança autossômica dominante, caracterizada pelo desenvolvimento de tumores endócrinos acometendo, principalmente, hipófise, paratireoide, pâncreas/duodeno endócrinos. É causada, principalmente, por mutação germinativa no gene supressor tumoral MEN1 (11q13). Outros genes foram, recentemente, relacionados a MEN1 (CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27Kip1 e AIP). O diagnóstico genético de famílias com MEN1 reconhece os portadores assintomáticos de mutação em MEN1, permite o diagnóstico e tratamento precoce de tumores, promove a redução da morbi-mortalidade relacionada à MEN1 e exclui familiares não portadores de mutação do rastreamento clínico periódico. O diagnóstico genético de MEN1 tem sido realizado por meio da técnica de sequenciamento Sanger, contemplando, a princípio, somente o gene MEN1. Entretanto, limitações desta técnica a tornam menos custo efetiva, devido a sua reduzida capacidade de geração de dados, que leva a necessidade de obtenção de produtos de PCR de até 600 pb para adequada leitura do sequenciamento. Além disto, condições específicas do gene MEN1, como a ausência de "hot spots" mutacionais, levam a necessidade de sequenciamento de toda sua extensão (9Kb) e contribuem para tornar esta técnica laboriosa e dispendiosa. A subdivisão do gene para sequenciamento Sanger pode ocultar informações, principalmente de regiões intrônicas, que podem ser importantes para o desenvolvimento da doença. Soma-se a isso a necessidade de estender o estudo gênico para os genes acima citados quando a análise do gene MEN1 é negativa. Uma vez que as limitações da técnica de Sanger também dificultam a análise destes genes, há a inviabilização da incorporação do diagnóstico gênico completo de MEN1 na prática clínica. O NGS (New Generation Sequencing) é uma nova ferramenta de sequenciamento genético que detêm maior capacidade e velocidade de geração de dados e maior cobertura de leitura gênica, incluindo regiões promotoras, intrônicas e regulatórias. Uma forte tendência tem sido mostrada de migração do sequenciamento Sanger para o NGS, incluindo a aplicação da mesma em diagnóstico genético de doenças complexas e de câncer hereditário. Entretanto, não há estudos prévios envolvendo NGS em MEN1. Os objetivos são: validação da técnica de NGS (Illumina MiSeq) utilizando como parâmetro o sequenciamento Sanger; avaliação de aspectos qualitativos e relação custo-benefício do NGS abrangendo o gene MEN1 e os demais genes recentemente relacionados a síndrome; excluir, por MLPA, grandes deleções germinativas MEN1 não encontradas por Sanger e NGS. Para tal, serão analisados 50 casos-índices com MEN1. Em avaliação preliminar, utilizando Ion PGM, foram analisados 4 casos-índices com mutação germinativa previamente conhecida no gene MEN1. Foi obtida uma cobertura média de leitura > 100x, com 100% da região alvo (gene MEN1) com no mínimo 10 reads, permitindo a avaliação com acurácia de todas as mutações germinativas. Também, foi encontrada uma média de 37 SNPs por paciente. Entretanto, inúmeros in/dels foram gerados dificultando a análise dos resultados. Este grande número de in/dels é causado por uma limitação específica da plataforma Ion PGM. Diante disto, optou-se pelo uso da plataforma Illumina MiSeq pela análise dos dados gerados serem fornecidos na própria plataforma, não resultar na geração de falsos in/dels e devido a menor probabilidade de erros frente às sequencias ricas em C-G, comuns no gene MEN1. O enriquecimento da amostra será realizado por meio de "long range PCR" que amplificará toda a região genômica dos genes MEN1, CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27Kip1 e AIP. Este projeto pretende, assim, introduzir o NGS como ferramenta de diagnóstico gênico de MEN1 em nosso meio.

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
CARVALHO, RAFAEL A.; URTREMARI, BETSAIDA; JORGE, ALEXANDER A. L.; SANTANA, LUCAS S.; QUEDAS, ELISANGELA P. S.; SEKIYA, TOMOKO; LONGUINI, VIVIANE C.; MONTENEGRO, FABIO L. M.; LERARIO, ANTONIO M.; TOLEDO, SERGIO P. A.; MARX, STEPHEN J.; TOLEDO, RODRIGO A.; LOURENCO JR, DELMAR M. Germline mutation landscape of multiple endocrine neoplasia type 1 using full gene next-generation sequencing. EUROPEAN JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY, v. 179, n. 6, p. 391-407, DEC 2018. Citações Web of Science: 3.

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