Geração de camundongo nocaute para o receptor nuclear órfão Coup-TFII: investigação dos mecanismos moleculares que determinam a expressão atrial-especifica do promotor do gene SMyHC3

• Processo: 15/10166-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Vigência (Início): 01 de setembro de 2015
• Vigência (Término): 30 de junho de 2017
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Morfologia - Embriologia
• Pesquisador responsável: José Xavier Neto
• Beneficiário: Ângela Saito
• Instituição Sede: Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (Brasil). Campinas , SP, Brasil
• Assunto(s): Receptores citoplasmáticos e nucleares Receptores nucleares órfãos Fator II de transcrição COUP Sistemas CRISPR-Cas CRISPR-Cas9 Expressão gênica diferencial Camundongos knockout
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Coup-Tfii | knockout | Programa de diferenciação atrial | Receptores nucleares | SMyHC3 | Biologia do Desenvolvimento Cardíaco

Resumo

A tecnologia CRISPR/Cas9 surgiu recentemente como uma eficiente alternativa para a geração de modificações específicas no genoma. Comparada às técnicas utilizadas anteriormente, CRISPR/Cas9 apresenta menor custo, maior eficiência e rapidez para editar o genoma em múltiplos tipos celulares e organismos. O sistema CRISPR/Cas9 baseia-se no uso de um pequeno RNA capaz de parear no locus de interesse do genoma e direcionar a endonuclease spCas9 para modificação do DNA. Devido à sua simplicidade e rapidez de geração, a técnica tornou-se um recurso viável em nosso ambiente. Nosso objetivo é utilizar a tecnologia CRISPR/Cas9 como a melhor abordagem possível para responder uma questão antiga do grupo: a identificação do regulador da expressão atrial-específica do gene slow myosin heavy chain 3 (SMyHC3), um transgene indicador do programa de diferenciação atrial em camundongos. Muitos resultados obtidos com várias técnicas ao longo dos últimos 15 anos apontam para o receptor nuclear COUPTF-II, implicado no desenvolvimento do átrio e sistema venoso, como o melhor candidato a ativador atrial do gene SMyHC3. Nosso grupo identificou uma região de 33 pares de base (pb) no promotor de SMyHC3 denominada Elemento Complexo de Resposta a Receptores Nucleares (ECRRN) e determinou os nucleotídeos do ECRRN responsáveis pela ativação atrial e repressão ventricular em embriões de camundongos transgênicos. Ensaios celulares de transativação do gene repórter da luciferase sob o controle do promotor de SMyHC3 demonstrou que a ativação desse promotor por COUP-TFII requer a presença do ECRRN. Também, ensaios de anisotropia de fluorescência apoiam a interação física entre COUP-TFII e ECRRN. Uma abordagem proteômica para a caracterização de interactores de COUPTF-II por meio de imunoprecipitação de COUPTF-II-FLAG revelou proteínas da via de transdução de sinal de receptores de andrógenos e de receptores de glucocorticóides. Consistentemente, ensaios de transativação mostraram que o promotor de SMyHC3 é ativado sinergicamente na presença de COUP-TFII e receptor de andrógeno. Um ensaio ainda mais restritivo com a região do ECRRN fusionada a um promotor basal também mostrou ativação sinérgica por COUP-TF-II e AR. Para estabelecer de forma fisiológica e definitiva se COUP-TFII é ou não o ativador da expressão atrial-específica de SMyHC3 in vivo, utilizaremos a tecnologia CRISPR/Cas9 para gerar uma linhagem de camundongos nocautes para o receptor nuclear COUP-TFII. Os embriões nocautes para COUP-TFII serão caracterizados, principalmente, quanto ao fenótipo atrial e ventricular como fonte de transcritos para uma análise de expressão diferencial contra embriões nativos. Fundamental para nossa análise também será a geração de um animal transgênico SMyHC3-eGFP, o qual expressa o gene repórter eGFP sob o controle do promotor SMyHC3. O teste definitivo de nossa hipótese será o exame da expressão do transgene SMyHC3-eGFP em camundongos nocautes para COUPTF-II. Para tanto, a linhagem contendo o alelo nocaute em heterozigose para COUP-TFII será acasalada com o transgene SMyHC3-eGFP. O nocaute para COUP-TFII no camundongo SMyHC3-eGFP também será utilizado para investigar o papel de COUP-TFII na capacidade de ligação do receptor de AR ao ECRRN. Para isso, este receptor será imunoprecipitado de estruturas sino-atriais do transgene SMyHC3-eGFP contendo o alelo nativo ou nocaute para COUP-TFII e a detecção da imunoprecipitação do promotor de SMyHC3 junto o receptor será realizada por PCR quantitativo em tempo real (ChIP-qPCR). Portanto, a caracterização da linhagem gerada do cruzamento do transgene SMyHC3-eGFP com a linhagem nocaute para COUP-TFII será uma importante abordagem para demonstração definitiva de que COUP-TFII regula a expressão atrial-específica de SMyHC3 e contribuirá para a elucidação dos mecanismos de regulação de COUP-TFII, em concerto com outros receptores nucleares, na ativação do programa de diferenciação atrial em camundongos. (AU)