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Avaliação do dano ao DNA em resposta ao efeito do expectador induzido pela radiação nas células-tronco mesenquimais

Processo: 15/18366-7
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2015
Vigência (Término): 31 de janeiro de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Biologia Geral
Pesquisador responsável:Ricardo Ambrósio Fock
Beneficiário:Amanda Nogueira Pedro
Supervisor no Exterior: Kathryn D. Held
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : Harvard University, Boston, Estados Unidos  
Vinculado à bolsa:13/23285-0 - Avaliação do efeito do expectador em células-tronco mesenquimais e na imunomodulação, BP.PD
Assunto(s):Radiação ionizante   Células-tronco mesenquimais   Dano ao DNA

Resumo

A exposição acidental e ocupacional à radiação ionizante (IR) pode induzir danos celulares em diversos organismos vivos em doses subletais. A energia depositada nas células induz a quebra de ligações químicas, danificando tanto estruturas básicas como o DNA, resultando em uma gama de lesões dentre as quais as quebras duplas de DNA (DSB) desempenham papel fundamental na determinação da sobrevivência celular frente à exposição a IR. As células possuem vários mecanismos para reparar o dano ao DNA, mas uma vez que ele não seja corretamente reparado ou na ausência de reparo, aberrações cromossômicas, perda de material genético e morte celular podem ocorrer como um efeito direto. Uma consequência das aberrações cromossômicas é a formação de micronúcleos (MN), resultado da fixação incorreta dos cromossomos aos fusos mitóticos no processo de segregação na anáfase. Células de mamíferos possuem mecanismos para reparar as DSB e prevenir os rearranjos cromossômicos, os quais envolvem uma série de moléculas, como as histonas H2AX. Sua ativação é um dos primeiros eventos nas células após a exposição a agentes danosos aos DNA. A fosforilação da H2AX ocorre na cromatina ao redor da DSB, onde centenas de moléculas de ³-H2AX se aglomeram induzindo a abertura da estrutura da cromatina, ou servindo de plataforma para o acúmulo de outros fatores envolvidos na resposta ao dano do DNA.A indução de dano ao DNA não é uma característica exclusiva de células irradiadas. Células ao redor das que foram diretamente expostas à IR podem exibir comportamento similar: elas morrem ou apresentam instabilidade cromossômica ou outras anormalidades. Este fenômeno é chamado de efeito do expectador. Estudos in vitro apontam duas principais vias envolvidas no efeito do expectador induzido pela radiação (RIBE): junções comunicantes e os fatores solúveis secretados pelas células. In vivo as respostas indiretas das células à IR são referidas como efeito abscopal, no qual o sistema imune parece desempenhar papel chave na indução da morte do tumor ou sua regressão, enquanto a instabilidade genômica, morte celular e transformação oncogênica de tecidos normais podem ocorrer em paralelo, constituindo um problema ainda sem solução. O conhecimento mais aprofundado dos mecanismos que envolvem o RIBE permitirão o desenvolvimento de estratégias mais apropriadas para o combate aos tumores e/ou à proteção de células de tecidos normais dos danos consequentes da exposição à IR. Considerando esta problemática, o objetivo deste trabalho é avaliar o dano ao DNA relacionado ao RIBE nas células-tronco mesenquimais (MSC), utilizando as seguintes estratégias: análise da formação de MN e quantificação de moléculas ³-H2AX. Para tanto, será utilizada a linhagem de células imortalizadas de embriões de camundongos C3H10T1/2. Para o sistema bystander, as MSC serão cultivadas em insertos (1 ¼m) e transferidas para poços contendo MSC irradiadas, imediatamente após a irradiação. A irradiação será realizada em aparelho de raio-X convencional (250 kVp), com uma taxa de dose de 300cGy/min, em doses únicas variando de 0,5 a 6 Gy. O dano cromossômico será avaliado pela técnica padrão para MN com bloqueio de citocinese utilizando citoclasina B; ao menos 500 células binucleadas em 10 diferentes campos serão examinadas em microscópio de fluorescência. Além disso os MN serão avaliados por citometria de fluxo utilizando um kit comercial (In Vitro MicroFlow®); a validação desta técnica para as MSC é vantajosa uma vez que análises baseadas na seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) permitem a coleta de múltiplos parâmetros simultaneamente, dando pistas sobre o modo de ação genotóxico (clastogenicidade ou aneugicidade). O dano ao DNA também será avaliado por citometria de fluxo, dado pela média da intensidade de fluorescência de ³ -H2AX. Coletivamente, estes ensaios contribuem significativamente na avaliação do RIBE nas MSC devido à especificidade destes na análise do dano ao DNA. (AU)

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