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Efeitos da indução da ativação e da inibição da via Wnt/beta-catenina por short hairpin RNA (shRNA) em linhagens celulares de tumores adrenocorticais e tratamento de modelo xenográfico com tumor adrenocortical com o composto PNU-74654

Processo: 15/10582-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de novembro de 2015
Vigência (Término): 31 de março de 2016
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina - Saúde Materno-infantil
Pesquisador responsável:Sonir Roberto Rauber Antonini
Beneficiário:Letícia Ferro Leal
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Endocrinologia pediátrica   beta Catenina   Esteroidogênese

Resumo

Contexto: não existe tratamento adjuvante eficaz para pacientes com tumores adrenocorticais (TAC) em estágio avançado ou recidivante. A ativação da via Wnt/beta-catenina é a alteração mais frequente em TAC podendo ser decorrente de mutações no gene CTNNB1 (beta-catenina) ou de alterações em inibidores da via Wnt/beta-catenina. Em estudo prévio, observamos ativação da via Wnt/beta-catenina em TAC pediátricos por redução da expressão de genes inibidores da via Wnt DKK3, SFRP1 e AXIN1. Objetivos: avaliar dos efeitos do silenciamento da beta-catenina e do DKK3 por short hairpin RNA (shRNA) sobre a Via Wnt/beta-catenina e o tratamento com PNU-74654, inibidor da via Wnt, em linhagem celular e cultura primária de tumores adrenocorticais e modelo xenográfico.Material e Métodos: realizaremos o silenciamento gênico da beta-catenina e do DKK3 por meio de shRNA e o tratamento das linhagens celulares tumorais de córtex adrenal (NCI-H295 e culturas primárias de TAC pediátricos) com PNU-74654, um inibidor da via Wnt/beta-catenina, para avaliar: (A) a expressão de beta-catenina e de genes-alvo da via Wnt/beta-catenina por meio de qPCR, imunofluorescência e western blot; (B) a viabilidade celular por meio de ensaio baseado em MTS; (C) a apoptose por meio de citometria de fluxo; (D) a invasão celular e transição epitélio-mesênquima por ensaio de migração; (E) a esteroidogênese pela quantificação por RIE ou ELISA dos hormônios Cortisol, Testosterona, Androstenediona e Aldosterona; (F) a expressão de enzimas ou fatores esteroidogênicos (STAR, CYP11B2, CYP21A2 e NR5A1/SF-1) por meio de qPCR e western blot. Adicionalmente, desenvolveremos um modelo xenográfico murino com a linhagem tumoral NCI-H295 para avaliar in vivo o efeito antitumoral do bloqueio da via Wnt/beta-catenina com PNU-74654. Perspectivas: os resultados deste trabalho poderão contribuir para o esclarecimento do papel da via Wnt/beta-catenina na tumorigênese adrenocortical e/ou esteroidogênese, com potencial de descoberta de novos alvos terapêuticos.