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Produção da proteína STC1 e anticorpos monoclonais para fins terapêuticos ou de acompanhamento da resposta clínica na leucemia linfóide aguda

Processo: 15/25284-7
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pesquisa Inovativa em Pequenas Empresas - PIPE  
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2015
Vigência (Término): 31 de maio de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Biologia Geral
Pesquisador responsável:Luís Antonio Peroni
Beneficiário:Luís Antonio Peroni
Empresa:Rheabiotec Desenvolvimento, Produção e Comercialização de Produtos de Biotecnologia Ltda (Rheabiotec)
Vinculado ao auxílio:15/08662-8 - Produção da proteína STC1 e anticorpos monoclonais para fins terapêuticos ou de acompanhamento da resposta clínica na leucemia linfóide aguda, AP.PIPE
Assunto(s):Biotecnologia   DNA recombinante   Stanniocalcina-1   Anticorpos monoclonais   Leucemia-linfoma linfoblástico de células precursoras   Baculoviridae   ELISA

Resumo

A aplicação de kits de imunodiagnósticos para diversas doenças que afetam a espécie humana é uma das ferramentas mais rápidas e seguras, permitindo o tratamento precoce dessas doenças. Para a produção destes kits, em um primeiro momento, é necessária a produção de proteínas ou peptídeos recombinantes de alvos específicos dos patógenos, com elevado grau de pureza e que repliquem as características estruturais e conformais da proteína nativa, e, em um segundo momento, anticorpos monoclonais com alta sensibilidade e afinidade, garantido um diagnóstico precoce, eficiente, rápido e preciso. A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é o câncer mais comum na infância. A proteína Stanniocalcina 1 (STC-1) foi identificada como sendo um potencial soro marcador da LLA, útil para fins de acompanhamento da resposta clínica ao tratamento. Este projeto visa a clonagem e expressão do gene da proteína STC-1 em bactérias E. coli e em sistema de baculovírus em células de inseto, bem como a expressão e purificação das proteínas recombinantes. Na segunda etapa, estas proteínas serão associadas à produção de anticorpos monoclonais de maneira a constituir um kit de diagnóstico baseado na técnica de ELISA, possibilitando um diagnóstico precoce dessa doença, com alta sensibilidade e confiança. O gene para a proteína STC1 (Genbank NM_003155) será amplificado a partir de células normais do estroma da medula óssea usando primers específicos e clonado no vetor pGEM e subclonado no vetor pET28a. Os vetores serão transfectados por eletroporação em linhagens procarióticas de E. Coli e através do sistema de expressão em baculovírus utilizando células de inseto. Os clones positivos serão confirmados por PCR utilizando primers universais no sistema procarioto e através da expressão de GFP no sistema de baculovírus. A expressão da proteína STC1 no sistema procarioto será induzida por IPTG e purificada por cromatografia de afinidade a níquel. No sistema de baculovírus, a proteína será produzida através da infecção das células com a cultura de baculovírus e purificada por cromatografia em três etapas: 1. troca iônica; 2. afinidade a níquel e 3. exclusão molecular. Todas as frações serão avaliadas por SDS-PAGE (Laemmli, 1970), ELISA Indireto (Clark, e 1986) e Western blot (Towbin, 1979) quanto a pureza, tamanho em kDa e reatividade para a cauda de histidina (6-His-tag) e através de um policlonal produzido em coelho, de modo a confirmar a identidade das mesmas nos diversos lotes produzidos no decorrer do projeto. Os resultados desta primeira etapa serão a padronização das metodologias de clonagem e expressão dessas proteínas, constituindo uma plataforma que permita a síntese desta e de futuras proteínas comercialmente, substituindo os similares importados e possibilitando ao corpo científico brasileiro ter acesso às proteínas recombinantes produzidas em território nacional e com preços e prazos menores do que os praticados por importação pelas empresas representantes. Em paralelo, com a plataforma de síntese estabelecida, o escalonamento da capacidade de produção e o desenvolvimento de anticorpos monoclonais para o estabelecimento de um diagnóstico ELISA para a detecção precoce da leucemia linfóide aguda constituirão os objetivos da segunda etapa do projeto. (AU)