L-asparaginase 1 de Saccharomyces cerevisiae: modificações racionais visando a modulação das características cinéticas sobre diferentes substratos

• Processo: 15/20866-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Vigência (Início): 01 de janeiro de 2016
• Vigência (Término): 31 de dezembro de 2016
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Marcos Antonio de Oliveira
• Beneficiário: Livia Cerf Quintero
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB-CLP). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/08617-7 - Produção de L-asparaginase extracelular: da bioprospecção à engenharia de um biofármaco antileucêmico, AP.TEM
• Assunto(s): Asparaginase Glutaminase Saccharomyces cerevisiae Manipulação genética Leucemia-linfoma linfoblástico de células precursoras
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: L-asparaginase | Leucemia linfoblástica aguda | Modificação Racional | Caracterização proteica

Resumo

A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é um tipo de neoplasia sanguínea muito frequente na população infanto-juvenil. As células neoplásicas de LLA, em contraste com as demais células do organismo, não sintetizam o aminoácido asparagina (Asn), sendo imprescindível a absorção deste aminoácido do meio extracelular para sua sobrevivência. Dessa forma, as L-asparaginases (ASPase) bacterianas são proteínas utilizadas no tratamento da LLA, visto que, depletam este aminoácido da corrente sanguínea, ocasionando a morte de células neoplásicas. Apesar de serem largamente utilizadas no tratamento da LLA, alguns autores atribuem diversos efeitos colaterais com a atividade de secundária de glutaminase (GLNase) destas enzimas. Entretanto, recentemente foi demonstrado que em ASPase de Escherichia coli (EcA), cuja a atividade de glutaminase foi diminuída ou abolida, a ocorrência de um grande decréscimo na citotoxidade da enzima sobre determinados tipos linhagens neoplásicas de LLA. Trabalhos envolvendo determinação da estrutura cristalográfica de EcA elucidaram diversos aminoácidos envolvidos na ligação com o substrato e catálise. Dentre eles, existem resíduos de Thr envolvidos nos processos supramencionados (Thr12 e Thr89) e estudos envolvendo mutagênese sítio dirigida em outras proteínas apontam que a substituição de Thr por Ser é capaz alterar significativamente os parâmetros cinéticos de EcA. Recentemente, também foi demonstrado que a substituição do resíduo de Asn24 de EcA por Ala, aumentou moderadamente a atividade de asparaginase. Análises em bancos de dados revelaram que Saccharomyces cerevisiae apresenta uma enzima denominada Asp1 com significativa homologia com EcA (~36% de identidade e ~54% de similaridade) e apresenta todos os aminoácidos envolvidos na catálise conservados, incluindo as Thr (Thr64 e Thr141). Entretanto, o resíduo de Asn24 é naturalmente substituído por uma Ala (76). Os objetivos deste trabalho residem na caracterização funcional e estrutural das enzimas recombinantes Asp1T64S, Asp1T141S, Asp1T64S/T141S e Asp1K247S, visando um melhor entendimento das atividades de asparaginase e de glutaminase. Primeiramente, as condições de expressão e purificação serão padronizadas. A caracterização estrutural será realizada por meio de SDS PAGE, cromatografia de exclusão molecular (SEC) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Já a avaliação das atividades sobre a Asn e a Gln será efetuada utilizando a metodologia de Nessler e o ensaio de estado estacionário de oxidação de NADH. Acreditamos que os resultados gerados neste projeto são de importância não só para a caracterização da enzima de S. cerevisiae, mas sim para um maior entendimento de aminoácidos envolvidos na catalise e ligação com substrato de ASPases, uma vez que os aminoácidos investigados são largamente conservados em ASPases dos mais diversos microrganismos.