Resumo
Proteínas de membrana são consideradas os novos desafios da Biologia estrutural dada a sua relevância médica. Mais de 50% dos alvos da indústria farmacêutica envolvem estas proteínas as quais representam cerca de 30% dos genomas de organismos. Com o objetivo de montarmos uma plataforma para a expressão e produção de proteínas de membrana em nosso laboratório, para uso em ensaios funcionais in vitro e estudos estruturais, escolhemos como alvos os transportadores do tipo ABC (do inglês, ATP_Binding Cassete) de Mycobacterium tuberculosis, uma das maiores famílias de proteínas integrais de membrana. Transportadores ABC apresentam grande relevância médica e farmacêutica uma vez que são relacionados ao desenvolvimento do fenômeno de múltipla resistência a drogas (MDR) no tratamento do câncer e resistência bacteriana, incluindo em tuberculose. Mycobacterium tuberculosis é o agente causador da tuberculose e cerca de 3% do seu genoma codifica para transportadores ABC. Apesar de identificados, não existem estudos funcionais sobre a extensa maioria destes transportadores e a possibilidade de caracterização de suas funções, bem como definição da faixa de substratos, é um passo para o desenvolvimento de novas formas de controle da doença. Neste sentido, um dos transportadores estudados pelo grupo é o transportador do tipo ABC de glutamina, codificado pelos genes Rv2563 (permease) e Rv2564 (ATPase). Durante o projeto de pós-doutoramento da Dra Ana Letícia Lusa (Proc. FAPESP 2012/23469-1), o complexo permease/ATPase foi expresso e purificado na presença de detergentes e submetido a ensaios espectroscópicos e de cristalização, os quais geraram cristais que difrataram com resolução máxima de 5 Å. Nas análises de bioinformática, a permease Rv2563 apresentou um domínio periplasmático não consensual de 196 resíduos, o qual acreditamos executar um papel essencial na captura da glutamina. No intuito de continuarmos a caracterização funcional e estrutural deste transportador, este projeto visa a caracterização do domínio periplasmático (Rv2563_per) e da ATPase isoladamente, bem como a produção da permease (Rv2563) e ATPase (Rv2564) em complexo. Os protocolos de expressão e purificação do complexo já estão estabelecidos e devem ser otimizados visando aumentar a qualidade dos cristais para resolução da estrutura tri-dimensional. Após a expressão e purificação dos domínios separadamente, estes serão submetidos a ensaios espectroscópicos de interação com glutamina e outros aminoácidos, ATP e inibidores de ATPase, e ensaios de co-cristalização na presença dos ligantes. Os resultados obtidos neste projeto serão de grande relevância científica uma vez que não há nenhuma caracterização estrutural ou mesmo funcional deste transportador em Mycobacterium ou organismo relacionado. (AU)
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