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Purificação de proteínas reconhecidas por anticorpos monoclonais produzidos a partir de células de osteossarcoma humano (MG-63) para sequenciamento por espectrometria de massa

Processo: 15/23096-9
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Pesquisa
Vigência (Início): 01 de fevereiro de 2016
Vigência (Término): 01 de março de 2016
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
Pesquisador responsável:Luciene Machado dos Reis
Beneficiário:Luciene Machado dos Reis
Anfitrião: Renato Costa Monteiro Filho
Instituição-sede: Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP (HCFMUSP). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm), França  
Assunto(s):Anticorpos monoclonais

Resumo

A partir de células MG-63 (osteossarcoma humano) produzimos 19 anticorpos monoclonais. Esses foram testados em células de cultura de explante de tecido ósseo normal e células hematopoiéticas, visando verificar sua especificidade e afastar reatividade cruzada com as células hematopoiéticas. Alguns dos clones foram sub-clonados e desde então estamos trabalhando com os sub-clones PSP 4-5 (100 kDa), PSP 42-22 (26 kDa) e PSP 85-9 (20 kDa). Esses anticorpos foram testados, por imunohistoquimica, em tecido humano normal (osso, músculo cardíaco, tecido adiposo, cartilaginoso e fibroblastos de pele) e não foram específicos para nenhum tecido/célula, ou seja, provavelmente reconhecem proteínas comuns originárias das células mesenquimais. Testamos esses anticorpos em células de cultura de explante de tecido ósseo normal e de doenças ósseas metabólicas (osteoporose, doença óssea adinâmica e osteíte fibrosa), evidenciando algumas diferenças interessantes no padrão de expressão de acordo com a doença. Em seguida, estudamos a expressão desses anticorpos em tumores ósseos (osteossarcomas, osteoblastomas, condrossarcomas e leiomiossarcomas) e detectamos diferenças relevantes entre osteossarcomas e osteoblastomas. No último ano, isolamos e sequenciamos o antígeno reconhecido pelo anticorpo PSP 42-22 (serologically defined colon cancer antigen 3 - SDCCAG3, com tamanho variando de 40 a 47 kDa, com quatro isoformas distintas descritas) e pelo PSP 85-9 (Yip1 interacting factor homolog B - YIF1B, com tamanho variando de 31 a 34 kDa com seis isoformas distintas), utilizando uma biblioteca de cDNA com capacidade de expressão proteica. Contudo, o tamanho das proteínas identificadas é menor do que o esperado, sugerindo ser um produto de "splicing". Para confirmar a identidade desses antígenos é necessário o sequenciamento por espectrometria de massa. Essa técnica exige a utilização das proteínas de forma extremamente pura. Assim, o objetivo do presente estudo será a obtenção dos antígenos puros através da imunoprecipitação do lisato proteico de células MG-63, utilizando os anticorpos monoclonais PSP 42-22 e PSP 85-9 conjugados à microesferas de Proteina G imobilizadas em Agarose. Uma vez identificadas as proteínas essas serão comparadas com as proteínas que identificamos com o sequenciamento do DNA.

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