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Estudos estruturais de fragmentos do trocador de Na+/Ca2+ por RMN em solução

Processo: 15/26356-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de abril de 2016
Vigência (Término): 31 de julho de 2017
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Roberto Kopke Salinas
Beneficiário:Tatiana Comporte Stabelini
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Ressonância magnética nuclear   Dobramento de proteína

Resumo

Proteínas de membrana estão envolvidas em processos fisiológicos essenciais como, por exemplo, a manutenção do equilíbrio iônico e sinalização intracelular. No entanto, apesar do seu envolvimento em inúmeros processos fisiológicos relevantes e de grande interesse farmacêutico, o estudo estrutural de proteínas de membrana ainda é um processo custoso, e muito mais complexo do que o estudo estrutural de proteínas globulares. Os trocadores de Na+/Ca2+ (NCX) formam uma família de transportadores de membrana que atuam na manutenção da homeostase de Ca2+ intracelular, e estão envolvidos em processos patológicos como doenças cardíacas. Os NCXs estão presentes em diversas espécies de mamíferos (NCXs) e insetos como Drosophila melanogaster (CALX). Estes trocadores apresentam dois domínios de 5 hélices transmembranares (TMH), responsáveis por promover o transporte específico de íons Ca2+ e Na+ através da membrana, e uma grande alça citoplasmática responsável por regular a atividade do trocador. Esta alça apresenta dois domínios sensores de Ca2+ intracelular (CBD1 e CBD2). O trocador CALX é inibido pela ligação de Ca2+, em CBD1 enquanto que os NCXs são ativados. A estrutura das regiões que conectam CBD1 e CBD2 às hélices transmembranares 5 e 6 é desconhecida. As regiões citosolicas próximas à TMH5 e TMH6 são bastante conservadas, ricas em resíduos hidrofóbicos e carregados positivamente (TMH5) ou com carga negativa (TMH6), e estão potencialmente envolvidas no mecanismo de regulação. Neste trabalho escolhemos estudar duas regiões do trocador CALX: a TMH5 e a TMH6 e suas respectivas vizinhanças próximas a membrana. Na ausência de dados estruturais sobre a proteína completa, o estudo destes fragmentos poderá auxiliar a compreender a estrutura e o funcionamento do trocador. Abordaremos ao longo deste estudo diferentes formas de expressar estes fragmentos em E. coli e por cell free, além de mimetizar o ambiente lipídico com diferentes modelos experimentais como detergentes, lipídios e polímeros anfipáticos.