RNAs não codificantes na doença renal diabética

• Processo: 16/04591-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2016
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2017
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
• Pesquisador responsável: Maria Lucia Cardillo Corrêa Giannella
• Beneficiário: Karina Thieme
• Supervisor: Andrew Advani
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina (FM). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of Toronto (U of T), Canadá
• Vinculado à bolsa: 14/17251-9 - Efeitos da administração crônica de albumina modificada por glicação avançada (AGE) sobre o tecido renal: caracterização do perfil inflamatório, antioxidante e epigenético, BP.PD
• Assunto(s): Endocrinologia MicroRNAs
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: diabetic nephropathy | epigenetic | miRNA | non-coding RNAs | podocyte | Endocrinologia

Resumo

Introdução: A nefropatia diabetica (ND) é a maior causa de doença renal terminal no mundo e novas terapias são necessárias com urgência. Os estudos focados em novos mecanismos da patofisiologia da doença renal diabética, bem como o desenvolvimento de potenciais novas intervenções terapêuticas, que têm como alvo RNAs não codificantes e mecanismos epigenéticos, são muito importantes. Esta proposta se baseia em um recente trabalho do grupo do Dr. Advani, no qual foi demostrado que o aumento na expressão da histona metiltransferase EZH2 (do inglês enhancer of zeste homolog 2), pela inibição do micro RNA miR-101, diminui a expressão da proteína de interação com a tiorredoxina (TxnIP, um inibidor de sistema antioxidante endógeno) e atenua o estresse oxidativo, na ND. Objetivos: A hipótese principal é de que o miR-101 promove injúria renal no diabetes. Os dois objetivos principais são: 1) determinar o efeito da inibição do miR-101 na estrutura e função renal em ratos diabéticos e 2) examinar os mecanismos pelos quais a inibição do miR-101 previne a injúria induzida por alta glicose, em podócitos. Métodos: OBJETIVO 1: Ratos machos Sprague Dawley (idade de 8 semanas, n=12/grupo), serão randomicamente selecionados para receber injeção na veia caudal de estreptozotocina (50 mg/kg, em tampão citrato de sódio 0,1 mol/L) ou tampão apenas; 24 horas depois, os animais serão novamente randomizados para receber inibidor do miR-101 (LNA-anti-microRNA-101, 2mg/kg) ou controle, 2 vezes na semana, por injeções subcutâneas. Os ratos receberão também injeções de insulina (1-4 unidades, 3 vezes na semana). Parâmetros metabólicos (peso corporal, glicemia, HbA1c, pressão arterial sistólica) e renais (proteinúria, albuminúria, ritmo de filtração glomerular, excreção de 8-OHdG e creatinina plasmática) serão continuamente avaliados. Após 8 semanas os animais serão eutanasiados e parâmetros da estrutura renal serão avaliados: 1) expressão de miR-101 por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR); 2) expressão proteica da EZH2 por immunoblotting; 3) expressão gênica (qPCR) e proteica (immunoblotting) de TXNIP; 4) ultraestrutura e número de podócitos por microscopia de transmissão eletrônica (MTE); 5) expansão mesangial e espessamento da membrana basal por TEM e análise semiquantitativa em cortes renais corados com ácido periódico de Schiff. OBJETIVO 2: Podócitos diferenciados de camundongo serão depletados de EZH2 pela transfecção de um mutante dominante negativo (flag-tagged EZH2) por vetor retroviral ou farmacologicamente utilizando DZNep (5¼M). Serão avaliadas a expressão gênica e proteica de TxnIP e a geração de espécies reativas de oxigênio (pelo metódo de CFDA e citometria de fluxo). Tendo confirmado que o aumento da expressão de EZH2 está implicada na prevenção do estresse oxidativo, avaliaremos se a inibição do miR-101 resulta em aumento da associação de EZH2 com o promoter da TxnIP, através da exposição dos podócitos ao LNA-anti-microRNA-101, na presença ou ausência de alta glicose. A associação será confirmada por ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e a trimetilação da histona 3 na lisina 27 neste sítio será determinada através de anticorpo anti-H3K27me3. Para determinar se o aumento da tiorredoxina (Trx) é o responsável pela prevenção do estresse oxidativo, os podócitos terão a Trx inibida (transfecção com adenovirus shRNA para Trx), antes da leitura de CFDA. Para determinar se a inibição do miR-101 regula a geração de espécies reativas de oxigênio através da NADPH oxidase (NOX), avaliaremos a expressão gênica e proteica da NOX4 e a sua atividade (método da lucigenina).Importância geral do estudo: com este estudo buscamos a proposição de novos mecanismos acerca do papel desempenhado pelo miR-101 na ND, em um momento em que a inibição de microRNAs tem recebido progressiva atenção como nova abordagem terapêutica.

Publicações científicas

(7)

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

BATCHU, SRI N.; THIEME, KARINA; ZADEH, FARIGOL H.; ALGHAMDI, TAMADHER A.; YERRA, VEERA GANESH; HADDEN, MITCHELL J.; MAJUMDER, SYAMANTAK; KABIR, M. GOLAM; BOWSKILL, BRIDGIT B.; LADHA, DANYAL; et al. The Dipeptidyl Peptidase 4 Substrate CXCL12 Has Opposing Cardiac Effects in Young Mice and Aged Diabetic Mice Mediated by Ca2+ Flux and Phosphoinositide 3-Kinase gamma. Diabetes, v. 67, n. 11, p. 2443-2455, NOV 2018. (16/04591-1)

THIEME, KARINA; MAJUMDER, SYAMANTAK; BRIJMOHAN, ANGELA S.; BATCHU, N.; BOWSKILL, BRIDGIT B.; ALGHAMDI, TAMADHER A.; ADVANI, SUZANNE L.; KABIR, M. GOLAM; LIU, YOUAN; ADVANI, ANDREW. EP4 inhibition attenuates the development of diabetic and non-diabetic experimental kidney disease. SCIENTIFIC REPORTS, v. 7, JUN 13 2017. (16/04591-1)

MAJUMDER, SYAMANTAK; HADDEN, MITCHELL J.; THIEME, KARINA; BATCHU, SRI N.; NIVEDITHA, DIVYA; CHOWDHURY, SHIBASISH; YERRA, VEERA GANESH; ADVANI, SUZANNE L.; BOWSKILL, BRIDGIT B.; LIU, YOUAN; et al. Dysregulated expression but redundant function of the long non-coding RNA HOTAIR in diabetic kidney disease. Diabetologia, v. 62, n. 11, p. 2129-2142, NOV 2019. (16/04591-1)

MAJUMDER, SYAMANTAK; THIEME, KARINA; BATCHU, SRI N.; ALGHAMDI, TAMADHER A.; BOWSKILL, BRIDGIT B.; KABIR, M. GOLAM; LIU, YOUAN; ADVANI, SUZANNE L.; WHITE, KATHRYN E.; GELDENHUYS, LAURETTE; et al. Shifts in podocyte histone H3K27me3 regulate mouse and human glomerular disease. Journal of Clinical Investigation, v. 128, n. 1, p. 483-499, JAN 2 2018. (16/04591-1)

BRIJMOHAN, ANGELA S.; BATCHU, SRI N.; MAJUMDER, SYAMANTAK; ALGHAMDI, TAMADHER A.; THIEME, KARINA; MCGAUGH, SARAH; LIU, YOUAN; ADVANI, SUZANNE L.; BOWSKILL, BRIDGIT B.; KABIR, M. GOLAM; et al. HDAC6 Inhibition Promotes Transcription Factor EB Activation and Is Protective in Experimental Kidney Disease. FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, v. 9, FEB 1 2018. (16/04591-1)

ALGHAMDI, TAMADHER A.; MAJUMDER, SYAMANTAK; THIEME, KARINA; BATCHU, N.; WHITE, KATHRYN E.; LIU, YOUAN; BRIJMOHAN, ANGELA S.; BOWSKILL, BRIDGIT B.; ADVANI, SUZANNE L.; WOO, MINNA; et al. Janus Kinase 2 Regulates Transcription Factor EB Expression and Autophagy Completion in Glomerular Podocytes. JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY, v. 28, n. 9, p. 2642-2654, SEP 2017. (16/04591-1)

THIEME, KARINA; VELOSO PEREIRA, BEATRIZ MARIA; DA SILVA, KAROLLINE S.; FABRE, NELLY T.; CATANOZI, SERGIO; PASSARELLI, MARISA; CORREA-GIANNELLA, MARIA LUCIA. Chronic advanced-glycation end products treatment induces TXNIP expression and epigenetic changes in glomerular podocytes in vivo and in vitro. Life Sciences, v. 270, APR 1 2021. (18/00573-4, 19/10583-0, 16/15603-0, 16/04591-1, 12/04831-1, 12/18724-2, 13/00713-7, 14/17251-9)