Construção de mutantes knock in de Leptospira biflexa saprofítica e validação de receptores de leptospira

• Processo: 16/07680-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
• Data de Início da vigência: 11 de julho de 2016
• Data de Término da vigência: 10 de janeiro de 2017
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Ana Lucia Tabet Oller do Nascimento
• Beneficiário: Luis Guilherme Virgílio Fernandes
• Supervisor: Mathieu Picardeau
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Institut Pasteur, França
• Vinculado à bolsa: 12/24164-0 - Caracterização da interação de Leptospira interrogans com o sistema protrombina/trombina e possíveis implicações na virulência, BP.DR
• Assunto(s): Leptospira Etiologia Leptospirose
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: adhesin | knock in | leptospira biflexa | mutants | receptors | Construção de mutantes

Resumo

O gênero Leptospira compreende tanto espécies patogênicas quanto saprofíticas. Leptospiras patogênicas são os agentes etiológicos da leptospirose, enquanto as bactérias saprofíticas são organismos de vida livre. A adesão de patógenos à matriz extracelular é considerada o estágio inicial e essencial para a infecção, e até o momento, nosso grupo tem reportado diversas proteínas recombinante de Leptospira com propriedades de ligação in vitro. Também, nós demonstramos recentemente a capacidade de leptospiras virulentas de se ligarem a trombina e outras moléculas da cascata de coagulação, sendo que alguns possíveis receptores foram descritos. O entendimento dos mecanismos responsáveis pela patogênese da leptospirose ainda é pouco compreendido, principalmente devido a carência de ferramentas moleculares disponíveis para este patógeno; alguns suttle vectors que se replicam tanto em Escherichia coli quanto na cepa saprofítica L. biflexa têm sido utilizados para expressão heteróloga de proteínas contidas em cepas patogênicas e validação de propriedades adesivas descritas in vitro. A cepa saprofítica L. biflexa é considerada um modelo mais "limpo" para a análise heteróloga da função de proteínas, uma vez que essa cepa carece de muitas proteínas envolvidas nos mecanismos de virulência apresentados pelas cepas patogênicas, as quais apresentam elevada redundância funcional, denotado pela ocorrência de várias proteínas com funções in vitro redundantes. Por esta razão, mutantes knock out de cepas patogênicas podem não produzir efeitos mensuráveis. Nosso objetivo com o presente projeto é validar as habilidades de ligação de várias proteínas recombinantes descritas em nosso laboratório em relação a vários componentes do hospedeiro, incluindo moléculas do sistema de coagulação. Para tal, os genes selecionados serão clonados juntamente com seus promotores no vetor replicativo, o qual será inserido na cepa saprofítica L. biflexa. Ensaios de adesão serão feitos para demonstrar o ganho de função devido à expressão heteróloga. Finalmente, a técnica será completamente implementada em nosso laboratório, como experimento de rotina. (AU)