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Avaliação, in vitro, do efeito de soluções desinfetantes para dentadura sobre a capacidade de produção de proteinase e fosfolipase e formação de hifas por espécies de Candida

Processo: 16/05189-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de julho de 2016
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2016
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Odontologia - Materiais Odontológicos
Pesquisador responsável:Cláudia Helena Lovato da Silva
Beneficiário:Laís Ranieri Makrakis
Instituição-sede: Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Materiais dentários   Próteses e implantes   Desinfetantes de equipamento odontológico   Higienizadores de dentadura   Agentes de controle de micro-organismos   Fosfolipases   Candida   Hifas   Técnicas in vitro

Resumo

O objetivo do estudo será avaliar, in vitro, o efeito de soluções higienizadoras (Triclosan, Cloramina T, R. communis a 10% e 2% e Hipoclorito de sódio a 0,25%) sobre a capacidade de produção de proteinase e fosfolipase e formação de hifas por C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis. Inicialmente, será determinada a concentração inibitória mínima (CIM) das soluções de Triclosan e Cloramina T pelo método de micro diluições em placas de cultura celular com 96 poços, em duplicata. Como fator de variação será considerado o meio de imersão (solução) em 5 níveis: GHS= espécimes contaminados e imersos em hipoclorito de sódio 0,25%; GT= espécimes contaminados e imersos em solução de Triclosan; GCt= espécimes contaminados e imersos em solução de Cloramina T; GRc10: espécimes contaminados e imersos em solução de R. communis a 10%; GRc: espécimes contaminados e imersos em solução de R. communis a 2%. Grupos controle serão formados para comprovar a formação do biofilme, onde os espécimes contaminados serão imersos em água destilada e para comprovar a esterilização com corpos de prova (n=6). Os biofilmes serão formados sobre espécimes circulares (13mm de diâmetro x 4mm de espessura) de resina acrílica termicamente ativada e estes serão imersos nas soluções por 20 minutos, enxaguados com PBS e imersos em meio de cultura líquido (Letheen) para processamento de acordo com o protocolo estabelecido para cada variável. A quantificação de proteinase será realizada por meio do kit fluorimétrico EnzChek® Protease Assay e avaliação da produção de Fosfolipase pelas espécies de Candida spp. será realizada por meio do kit fluorimétrico Amplex Red® phosphatidylcholine-specific phospholipase C assay. Para quantificação de hifas, 100µL oriundos da suspensão celular em meio Letheen, serão transferidos para o meio "yeast extract peptona dextrose" (YEPD) e cultivados durante 2 dias. Subcultivos serão obtidos em 5 mL do meio de crescimento "yeast 23 ammonium dextrose" por 48 horas a 30°C, sob agitação. A seguir, as culturas serão centrifugadas (5 minutos a 10ºC), lavadas 2 vezes com 5 mL de PBS e transferidas (3 x 106 células/mL) para 5 mL de meio indutor de hifas (meio 199) acrescido com 10% de soro fetal bovino. As células serão incubadas a 37°C, durante 3 horas. A contagem de células (leveduras + hifas) será realizada em câmara de Neubauer. As análises serão realizadas em triplicada. Os dados obtidos serão submetidos às análises de normalidade (Teste de Shapiro-Wilkis) e homocedasticidade (Teste de Levene) para definição do teste estatístico pertinente. As análises serão conduzidas a um nível de significância de 5%.