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Análise da atividade e perfil de expressão da proteína Dicer em condições de estresse de aldeídos: possível papel protetor da enzima ALDH2

Processo: 16/00900-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de julho de 2016
Vigência (Término): 01 de setembro de 2018
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Fisiologia - Fisiologia de Órgãos e Sistemas
Pesquisador responsável:Julio Cesar Batista Ferreira
Beneficiário:Ligia Akemi Kiyuna
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Bolsa(s) vinculada(s):17/14426-0 - Regulação pós-traducional de dicer mediada por estresse oxidativo: caracterização estrutural e funcional da interação 4-hne-dicer, BE.EP.MS
Assunto(s):Estresse oxidativo   Dicer   Fisiologia cardiovascular   Doenças cardiovasculares

Resumo

O estresse oxidativo está associado ao estabelecimento e progressão de diversas patologias. Além da sua ação direta sobre os constituintes celulares, as espécies reativas de oxigênio (EROs) são responsáveis pela geração de outras moléculas pró-oxidantes, como é o caso do aldeído 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE), produto da peroxidação lipídica. Esse aldeído apresenta alta reatividade com biomoléculas, sendo capaz de formar ligações de alta afinidade (adutos) com proteínas, lipídios e DNA, as quais estão associadas à modificação da função e degradação de seus alvos, de modo que seu acúmulo tem sido correlacionado ao desenvolvimento de inúmeras doenças como o câncer, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares.Experimentos preliminares do nosso laboratório utilizando ratos com insuficiência cardíaca (IC) identificaram um aumento significativo nos níveis de 4-HNE cardíaco, associado ao desenvolvimento da patologia. Adicionalmente, realizamos uma proteômica com o intuito de verificar quais proteínas cardíacas formavam adutos com o 4-HNE na IC. Dentre os resultados obtidos, foi identificada a formação de adutos de Michaelis entre 4-HNE e três resíduos da proteína DICER (K1324, H1325 e H1339). A DICER é uma endonuclease essencial na biogênese dos miRNAs, e consequentemente, na regulação gênica pós-transcricional. Trabalhos recentes demonstraram que a exposição ao estresse oxidativo reduz a expressão da DICER. Entretanto, os mecanismos envolvidos nesse processo, bem como sua contribuição na biogênese de miRNA, regulação gênica pós-transcricional e funcionamento celular ainda não foram elucidados. Nesse contexto, o objetivo do presente projeto de pesquisa é caracterizar o 4-HNE como agente regulador da DICER em condições de estresse oxidativo. Para isso, validaremos nossos achados iniciais de interação entre 4-HNE e DICER na IC. Além disso, caracterizaremos as consequências dessa interação na atividade e perfil de expressão da DICER em cultura celular (células HEK 293 e H9C2), em lisado tecidual, e in vivo utilizando o nematoide Caenorhabditis elegans que expressa constitutivamente o constructo DICER-GFP. Por fim, validaremos o potencial da ativação seletiva da enzima aldeído desidrogenase 2 (ALDH2) na prevenção ou redução da interação 4-HNE-DICER. Vale ressaltar que a ALDH2 é a principal enzima envolvida na degradação do 4-HNE. No projeto, o estresse será induzido nas células e nos nematoides por Paraquat (gerador de ânion superóxido) ou 4-HNE. A atividade da DICER será avaliada de duas maneiras distintas: para os ensaios em cultura celular utilizaremos real time imaging em células HEK 293 modificadas (RNAi-293-EGFP/RFP); já no lisado celular ou tecidual utilizaremos um molecular Beacon específico para a DICER. O perfil de expressão da DICER será avaliado por qPCR e Immunoblotting no lisado celular ou tecidual; e por real time imaging nos nematoides através da fluorescência emitida pela DICER-GFP. Nossa hipótese é que o acúmulo de 4-HNE no estresse oxidativo prejudica diretamente a atividade e/ou perfil de expressão da DICER através do aduto 4-HNE-DICER. Nossos resultados preliminares são promissores, demonstrando que o tratamento com 4-HNE compromete a biogênese de siRNA em células HEK ao longo do tempo. Para esse projeto contaremos com a colaboração dos Profs. Marcelo Mori (UNIFESP), Mario Hirata (FCF-USP) e Daria Mochly-Rosen (Stanford University).

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
KIYUNA, LIGIA AKEMI; PRESTES E ALBUQUERQUE, RUDA; CHEN, CHE-HONG; MOCHLY-ROSEN, DARIA; BATISTA FERREIRA, JULIO CESAR. Targeting mitochondrial dysfunction and oxidative stress in heart failure: Challenges and opportunities. Free Radical Biology and Medicine, v. 129, p. 155-168, DEC 2018. Citações Web of Science: 11.
Publicações acadêmicas
(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)
KIYUNA, Ligia Akemi. Análise da atividade e expressão da proteína Dicer em condições de estresse de aldeídos: possível papel protetor da enzima ALDH2.. 2018. Dissertação de Mestrado - Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas São Paulo.

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