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Papel das Vias de Sinalização de Wnt no Potencial Osteogênico de Superfície de Titânio com Nanotopografia

Processo: 16/14711-4
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de novembro de 2016
Vigência (Término): 08 de abril de 2019
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Odontologia - Cirurgia Buco-maxilo-facial
Pesquisador responsável:Márcio Mateus Beloti
Beneficiário:Rodrigo Paolo Flores Abuna
Instituição-sede: Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Nanotopografia   Osteoblastos   Osso e ossos   Proteínas Wnt   Implantodontia   Titânio

Resumo

A superfície de titânio (Ti) com nanotopografia, obtida por condicionamento com solução de H2SO4/H2O2, tem grande potencial osteogênico por modular vias de sinalização envolvidas na diferenciação osteoblástica, como por exemplo as vias de integrinas e proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs). Considerando a participação importante de vias de Wingless-Type mouse mammary tumor vírus [MMTV] Integration Site (Wnt) no processo de osteogênese, nós elaboramos a hipótese de que essas vias estão, ao menos em parte, envolvidas no potencial osteogênico da superfície de Ti com nanotopografia. Para testar essa hipótese, células osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 serão cultivadas sobre discos de Ti com nanotopografia e usinados (controle) e será avaliada a expressão gênica, por PCR em tempo real, de marcadoresdas vias de Wnt canônica e não-canônica Wnt/Ca2+. A partir dos resultados de expressão gênica, serão selecionados um gene-alvo da via de sinalização de Wnt canônica e um da vianão-canônica regulados de forma mais intensa pela superfície de Ti com nanotopografia para a aquisição de agrupados de curtas repetições palindrômicas regularmente interespaçadas(CRISPR-Cas9/gRNA) que serão utilizados para o silenciamento dos dois genes-alvos de interesse. A eficácia do silenciamento dos CRISPR-Cas9/gRNA será avaliada por PCR em tempo real e Western blot para determinar a expressão gênica e proteica, respectivamente, dos dois genes-alvos. Em seguida, células da linhagem MC3T3-E1 serão transduzidas com os CRISPR-Cas9/gRNA relacionados às vias de Wnt canônica e não-canônica Wnt/Ca2+ previamente selecionados, na concentração pré-determinada. As transduções serão feitas da seguinte forma: (1) CRISPR-Cas9/gRNA para a via de Wnt canônica, (2) CRISPR-Cas9/gRNA para a via não-canônica Wnt/Ca2+, (3) CRISPR-Cas9/gRNA para as vias de Wnt canônica e nãocanônica Wnt/Ca2+ ou (4) controle (CRISPR-Cas9 sem gRNA). As células transduzidas, e consequentemente com as vias de Wnt canônica e/ou não-canônica silenciadas, serão cultivadas sobre as superfícies de Ti com nanotopografia e controle para a avaliação de: (1) expressão de genes relacionados às vias de sinalização de Wnt canônica e não-canônica e dos marcadores osteoblásticos RUNX2, osterix (OSX), fosfatase alcalina (ALP) e osteocalcina (OC), por PCR em tempo real, (2) expressão proteica de RUNX2, por Western blot, e (3) atividade de ALP. Os dados quantitativos serão obtidos em quintuplicata (n=5) e submetidos ao teste de aderência à curva normal e homegeneidade de variâncias. Caso seja detectada normalidade dos dados, será aplicado o teste-t ou ANOVA (para comparação de 2 grupos e comparações múltiplas, respectivamente) ou se não, o teste Mann Whitney ou Kruskal-Wallis serão aplicados. O nível de significância adotado será de 5%.

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
FLORES ABUNA, RODRIGO PAOLO; OLIVEIRA, FABIOLA SINGARETTI; ADOLPHO, LETICIA FAUSTINO; FERNANDES, ROGER RODRIGO; ROSA, ADALBERTO LUIZ; BELOTI, MARCIO MATEUS. Frizzled 6 disruption suppresses osteoblast differentiation induced by nanotopography through the canonical Wnt signaling pathway. Journal of Cellular Physiology, APR 2020. Citações Web of Science: 0.
ABUNA, RODRIGO P. F.; OLIVEIRA, FABIOLA S.; LOPES, HELENA B.; FREITAS, GILEADE P.; FERNANDES, ROGER R.; ROSA, ADALBERTO L.; BELOTI, MARCIO M. The Wnt/beta-catenin signaling pathway is regulated by titanium with nanotopography to induce osteoblast differentiation. COLLOIDS AND SURFACES B-BIOINTERFACES, v. 184, DEC 1 2019. Citações Web of Science: 4.

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