Produção de linhagens transgênicas de roughest em Drosophila melanogaster e sua caracterização fenotípica

• Processo: 16/24547-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2017
• Data de Término da vigência: 28 de fevereiro de 2018
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Morfologia - Citologia e Biologia Celular
• Pesquisador responsável: Ricardo Guelerman Pinheiro Ramos
• Beneficiário: Vitor Santana Soares Rodrigues
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Assunto(s): Adesão celular Biologia do desenvolvimento Drosophila melanogaster Animais geneticamente modificados Fenótipo
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: adesão celular | Drosophila | Gal4 | IrreC Recognition Module (IRM) | sistema UAS | Biologia do Desenvolvimento

Resumo

O gene roughest (rst) apresenta caráter pleiotrópico, tendo seu envolvimento descrito em diversos processos do desenvolvimento de Drosophila melanogaster, tais como direcionamento axonal, histólise de glândulas salivares, formação da musculatura embrionária e diferenciação das células pigmentares durante o processo de desenvolvimento do olho composto. A proteína codificada por esse locus é transmembrana, unipasso, com cinco domínios imunoglobulinas na porção extracelular (509 aminoácidos) e uma cauda citoplasmática (208 aminoácidos) contendo diversos resíduos de serina e treonina fosforiláveis e com subdomínios funcionalmente importantes - como uma região rica em glutaminas conhecida como domínio opa-like. Em nosso laboratório foram construídas linhagens transgênicas de D. melanogaster contendo porções truncadas de Roughest sob controle de promotores de choque térmico (hsp70) e Glass-multimer-reporter (expressão restrita ao olho composto). Foi observado que a superexpressão de construções contendo apenas o domínio extracelular da proteína levavam a defeitos na histólise da glândula salivar larval e do olho composto, bloqueio na celularização da blastoderme e interferência na formação embrionária da linha média do sistema nervoso central. Contudo, a expressão generalizada e interferência no processo de desenvolvimento integral, no caso da expressão mediada pelo promotor de hsp70, e a especificidade da expressão do promotor GMR, dificultam uma dissecção mais fina do papel de diferentes porções da proteína no desenvolvimento do inseto. Com o objetivo de contornar este problema e elucidar os efeitos produzidos por versões trucadas do domínio intracelular de Rst em tecidos de Drosophila melanogaster, será utilizado o sistema de expressão bipartido UAS/Gal4 (Ptashne 1988): um cDNA contendo a ORF completa de rst (cDNA-HB3, Ramos et al., 1993) será digerido para obtenção de diferentes regiões codificantes de porções específicas da proteína, e, subsequentemente, clonadas em vetor pUAST, para expressão sob controle do promotor UAS. Após isso, serão realizadas micro-injeções em embriões de Drosophila melanogaster, para obtenção de animais transformantes. Análises iniciais do desenvolvimento de diferentes tecidos, como ovário adulto e glândula salivar larval, serão então realizadas sob o efeito da superexpressão tecido-específica (mediada por um gene driver ligado à expressão do ativador de UAS, GAL4) das porções de Roughest. (AU)