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Caracterização de mutações PHO-constitutivas em Escherichia coli

Processo: 17/04130-7
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de maio de 2017
Vigência (Término): 30 de abril de 2018
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Beny Spira
Beneficiário:Claudia Ramos de Carvalho Pinto
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Escherichia coli   Genética bacteriana   Microbiologia   Regulon   Mutação

Resumo

O regulon PHO de E. coli é formado por mais de 30 genes, que respondem, conjuntamente, à disponibilidade de ortofosfato (Pi) no meio. O excesso de Pi no periplasma reprime a transcrição dos genes de PHO, ao passo que, em baixas concentrações de Pi no meio, os genes pertencentes ao regulon PHO têm a sua expressão ativada. O controle da transcrição do regulon PHO é realizado pelo sistema de dois componentes PhoB-PhoR e pelo sistema de transporte PstSCAB-PhoU. Outros dois sistemas relacionados à captação de Pi são importantes para este projeto: o transportador de Pi, PitA, o transportador de glicerol-3- fosfato, Ugp e a enzima fosfatase alcalina, que é o repórter utilizado para identificar o nível de ativação do regulon PHO. Mutantes PHO-constitutivos são aqueles que perderam a capacidade de reprimir a transcrição dos genes de PHO na presença de excesso de Pi no meio. Tais mutantes podem ser isolados na presença de glicerol-2- fosfato (G2P) como única fonte de carbono. Todos os mutantes PHO-constitutivos já isolados, contém mutações em um dos cinco genes do operon pstSCAB-phoU ou no gene phoR. A proposta deste projeto é localizar e identificar molecularmente mutantes PHO-constitutivos isolados, no laboratório, em placas de G2P. O gene afetado pela mutação será localizado através de ensaios de complementação in-trans e, em seguida, sequenciado. Além disso, o nível de constitutividade de cada mutante (atividade da fosfatase alcalina) será medido e correlacionado com o gene afetado e com o tipo de mutação, que pode ser um indel, ou substituição (transição ou transversão) e também em relação ao possível efeito polar (polaridade da mutação). O locus e tipo de mutação serão também correlacionados com o dia de surgimento da colônia mutante na placa de seleção. (AU)