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Aplicação de CRISPR-interferência na elucidação da patogênese da leptospirose e desenvolvimento de novas estratégias para obtenção de mutantes knockout

Processo: 17/06731-8
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de julho de 2017
Vigência (Término): 31 de julho de 2022
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Ana Lucia Tabet Oller do Nascimento
Beneficiário:Luis Guilherme Virgílio Fernandes
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:19/17488-2 - Avançando no entendimento da patogenicidade e virulência da Leptospira interrogans através de análises proteômicas, estruturais, mutagênicas e imunológicas, AP.TEM
Bolsa(s) vinculada(s):19/20302-8 - Silenciamento de RNA não-codificador (ncRNA) mediado por interferência CRISPR (CRISPRi) em cepas saprofíticas e patogênicas de Leptospira, BE.EP.PD
Assunto(s):Leptospirose   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas   Proteína 9 associada à CRISPR   Inativação gênica   Leptospira

Resumo

A leptospirose é uma zoonose de importância global recentemente incluída na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas. Em áreas urbanas, os roedores desempenham o papel de principais reservatórios da doença por permitirem a colonização das leptospiras nos túbulos renais proximais e as excretarem vivas na urina. Segundo a Organização Mundial da Saúde, o número de casos clínicos anuais no mundo permanece subestimado. O melhor entendimento da patogênese da bactéria é um ponto crucial para o desenvolvimento de uma vacina eficaz. A geração de mutantes de Leptospira é uma peça chave na elucidação de fatores de virulência e da biologia básica da bactéria. Durante o desenvolvimento do Projeto de Pós-Doutorado (2017/06731-8 e BEPE 2019/20302-8), foi desenvolvida a ferramenta de CRISPR-interferência para silenciamento gênico epissomal e completo em estirpes saprofíticas e patogênicas, sendo que pela primeira vez na literatura espécies além de L. interrogans foram manipuladas. O sistema de CRISPRi desenvolvido requer a síntese constitutiva de uma proteína dCas9 ("dead" Cas9) e de um RNA guia (sgRNA), o qual direciona a proteína para os alvos de interesse, bloqueando a transcrição. Esta ferramenta tem se mostrado extremamente útil na elucidação in vitro e in vivo do papel de proteínas de Leptospira spp.. Neste contexto, nosso grupo apresenta inúmeros genes potenciais para silenciamento por esta técnica, sendo que com este período adicional, pretende-se aplicar e difundir a técnica de CRISPRi em nosso laboratório, bem como explorar estes alvos potenciais. Também pretende-se desenvolver novos plasmídeos para knockout genético, por meio da utilização da enzima Cas9 e co-expressão com proteínas de Mycobacterium tuberculosis que atuam no reparo da quebra genômica induzida pela enzima.

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Publicações científicas (8)
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
DAROZ, BRENDA BEVILAQUA; VIRGILIO FERNANDES, LUIS GUILHERME; TEIXEIRA, ALINE FLORENCIO; TABET OLLER NASCIMENTO, ANA LUCIA. In Silico Structural and Functional Characterization of HtrA Proteins of Leptospira spp.: Possible Implications in Pathogenesis. TROPICAL MEDICINE AND INFECTIOUS DISEASE, v. 5, n. 4 DEC 2020. Citações Web of Science: 0.
TEIXEIRA, ALINE F.; CAVENAGUE, MARIA F.; KOCHI, LEANDRO T.; FERNANDES, LUIS G.; SOUZA, GISELE O.; DE SOUZA FILHO, ANTONIO FRANCISCO; VASCONCELLOS, SILVIO A.; HEINEMANN, MARCOS BRYAN; NASCIMENTO, ANA L. T. O. Immunoprotective Activity Induced by Leptospiral Outer Membrane Proteins in Hamster Model of Acute Leptospirosis. FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, v. 11, OCT 30 2020. Citações Web of Science: 0.
KOCHI, LEANDRO TOSHIO; FERNANDES, LUIS GUILHERME VIRGILIO; NASCIMENTO, ANA LUCIA TABET OLLER. Heterologous Expression of the Pathogen-Specific LIC11711 Gene in the Saprophyte L. biflexa Increases Bacterial Binding to Laminin and Plasminogen. PATHOGENS, v. 9, n. 8 AUG 2020. Citações Web of Science: 0.
TEIXEIRA, ALINE F.; FERNANDES, V, LUIS G.; CAVENAGUE, MARIA F.; TAKAHASHI, MARIA B.; SANTOS, JADEMILSON C.; PASSALIA, FELIPE J.; DAROZ, BRENDA B.; KOCHI, LEANDRO T.; VIEIRA, MONICA L.; NASCIMENTO, ANA L. T. O. Adjuvanted leptospiral vaccines: Challenges and future development of new leptospirosis vaccines. Vaccine, v. 37, n. 30, p. 3961-3973, JUL 9 2019. Citações Web of Science: 1.
FERNANDES, L. G. V.; GUAMAN, L. P.; VASCONCELLOS, S. A.; HEINEMANN, MARCOS B.; PICARDEAU, M.; NASCIMENTO, A. L. T. O. Gene silencing based on RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9): a new tool for genetic engineering in Leptospira. SCIENTIFIC REPORTS, v. 9, FEB 12 2019. Citações Web of Science: 0.
KOCHI, LEANDRO T.; FERNANDES, V, LUIS G.; SOUZA, GISELE O.; VASCONCELLOS, SILVIO A.; HEINEMANN, MARCOS B.; ROMERO, ELIETE C.; KIRCHGATTER, KARIN; NASCIMENTO, ANA L. T. O. The interaction of two novel putative proteins of Leptospira interrogans with E-cadherin, plasminogen and complement components with potential role in bacterial infection. VIRULENCE, v. 10, n. 1, p. 734-753, JAN 1 2019. Citações Web of Science: 0.
NASCIMENTO FILHO, EDSON G.; VIEIRA, MONICA L.; TEIXEIR, ALINE F.; SANTOS, JADEMILSON C.; FERNANDES, LUIS G. V.; PASSALIA, FELIPE J.; DAROZ, BRENDA B.; ROSSINI, AMANDA; KOCHI, LEANDRO T.; CAVENAGUE, MARIA F.; PIMENTA, DANIEL C.; NASCIMENTO, ANA L. T. O. Proteomics as a tool to understand Leptospira physiology and virulence: Recent advances, challenges and clinical implications. JOURNAL OF PROTEOMICS, v. 180, n. SI, p. 80-87, MAY 30 2018. Citações Web of Science: 1.
TEIXEIRA, ALINE F.; FERNANDES, LUIS G. V.; SOUZA FILHO, ANTONIO; SOUZA, GISELE O.; VASCONCELLOS, SILVIO A.; HEINEMANN, MARCOS B.; NASCIMENTO, ANA L. T. O. Evaluation of Lsa46 and Lsa77 Leptospiral Proteins for Their Immunoprotective Activities in Hamster Model of Leptospirosis. BIOMED RESEARCH INTERNATIONAL, 2018. Citações Web of Science: 2.

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