Terapia de Resgate na Doença Renal Policística Autossômica Dominante Dirigida a Mutações Missense Através da Suprarregulação ou Ativação do Fator de Transcrição XBP1

• Processo: 17/07912-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Pesquisa
• Vigência (Início): 20 de setembro de 2017
• Vigência (Término): 19 de setembro de 2018
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
• Pesquisador responsável: Bruno Eduardo Pedroso Balbo
• Beneficiário: Bruno Eduardo Pedroso Balbo
• Pesquisador Anfitrião: Stefan Somlo
• Instituição Sede: Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP (HCFMUSP). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Local de pesquisa: Yale University, Estados Unidos
• Assunto(s): Nefrologia Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas Policistina-1 Proteína 9 associada à CRISPR
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cas9 | Crispr | doença renal policística autossômica dominante | Policistina-1 | Terapia com chaperone molecular | terapia de resgate | xbp1 | Nefrologia

Resumo

Terapia de Resgate na Doença Renal Policística Autossômica Dominante Dirigida a Mutações Missense Através da Suprarregulação ou Ativação do Fator de Transcrição XBP1Introdução: A doença renal policística autossômica dominante (DRAPD) é a doença renal monogênica mais comum, ocorrendo por mutação em um de dois genes, PKD1 e PKD2, que codificam respectivamente a policistina-1 (PC1) e a policistina-2 (PC2). A natureza focal dos cistos na DRPAD resulta na perda de função em ambos os alelos PKD1 ou PKD2. Além disso, estas mutações comprometem a função ciliar, na qual o nível de PC1 é central na modulação da doença.Justificativa: A evidência de um mecanismo comum entre a doença hepática policística autossômica dominante (DHPAD) e a DRPAD tem permitido melhor entendimento no processo de cistogênese. A DHPAD caracteriza-se por múltiplos cistos hepáticos semelhante à DRPAD mas sem cistos renais. A DHPAD resulta na mutação em um de dois genes, PRKCSH ou SEC63, que codificam respectivamente a glicosidade IIß e a SEC63p, proteínas expressas no retículo endoplasmático. Evidência recente demonstrou que SEC63p é necessária para expressão de PC1-PC2 e que os níveis de PC1 constituem o limite neste processo. Uma vez que GIIß e SEC63p correlacionam-se com a resposta a proteínas mal enoveladas (UPR), levantou-se a hipótese de que este processo poderia interferir com a cistogênese. Demonstrou-se que a deficiência de SEC63p ativa a via IRE1±-XBP1 da UPR, resultando em supra-regulação de proteínas chaperone para compensar a sobrecarga de proteínas mal enoveladas. Além disso, a inativação de XBP1 agrava o fenótipo cístico em modelos deficientes em Sec63 de uma maneira dependente de PC1, indicando que a ativação de XBP1 poderia resgatar o processo. Tais achados sugerem que terapia com chaperones poderia ser útil em mutações resultam na diminuição da expressão de PC1.Objetivos: Avaliar se a redução funcional de PC1 por mutação missense é suscetível ao resgate por chaperones moleculares. Objetivos específicos: 1) Gerar linhagens celulares e modelos animais específicos utilizando tecnologia de edição genômica: Planejamos desenvolver linhagens celulares e modelos animais modificados utilizando o sistema CRISPR-Cas9 com o objetivo de investigar se as mutações p.R2220W e p.E2771K, descritas em pacientes, são suscetíveis ao resgate por terapia chaperone.2) Realizar estudos in vitro para avaliar expressão e tráfego de policistina-1: Células LLC-PKD1 sem PC1 e PC2 endógenas serão utilizadas como um bioensaio para investigar expressão e tráfego de PC1 e PC2 modificadas geneticamente através de métodos de imagem com fluorescência.3) Investigar os efeitos de policistina-1 mutante em células que expressam cílio apical primário: Planejamos inativar Pk1 e Pkd2 em células IMCD3, modelo para análise do cílio apical primário, para analisar os efeitos celulares de PC1 mutante, rastreando a mesma com epitopos marcados.4) Gerar animais geneticamente modificados a partir de mutações missense em Pkd1 descritas em pacientes com DRPAD: Planejamos gerar modelos animais a partir das mutações missense acima descritas em Pkd1 pelo sistema CRISPR-Cas9.5) Avaliar se a hiperexpressão de XBP1 resgata a biogênese e tráfego de policistina-1 mutante: Examinaremos os efeitos in vitro da forma ativa de XBP1 (XBP1s) em PC1 hipomórfica e marcada por FLAGs nas regiões N- e C-terminal e por epitopos HA. Para gerar ativação de XBP1s usaremos um modelo animal com XBP1s inserido no locus ROSA26. Neste caso, a ativação de Cre recombinase remove um cassete de parada, ativando a expressão de XBP1s. Neste cenário, geraremos um animal ROSA-XBP1s; mutante Pkd1-BAC a ser cruzado com o modelo Pax8-rtTA; TetO-Cre; Pkd1flox/flox. Ativação por doxiciclina inativará Pkd1 endógeno, enquanto ativa a expressão de XBP1s. À medida que XBP1s resgata PC1 mutante em tecido renal, avaliaremos os benefícios de terapia chaperone comparando-os a camundongos sem aumento de expressão em XBP1s.