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Análise de especificidades de Importinas-± de diferentes organismos por técnicas estruturais e calorimétricas

Processo: 17/10571-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de agosto de 2017
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2018
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
Pesquisador responsável:Marcos Roberto de Mattos Fontes
Beneficiário:Cíntia Akemi Fukuda
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IBB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:13/24705-3 - O fungo filamentoso Neurospora crassa como um organismo modelo para a caracterização funcional de proteínas/fatores de transcrição que regulam o metabolismo de carboidratos, AP.TEM
Assunto(s):Carioferinas   Cristalografia   Calorimetria   Comunicação celular

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nessa via, a proteína Importina-± (Imp±) atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). A estrutura da proteína Imp± já foi elucidada e caracterizada em alguns organismos. Através da análise das sequências de aminoácidos dessas proteínas, foi possível classificá-las em três subfamílias: ±1, ±2, e ±3. As diferenças entre as proteínas Imp± de cada família evidenciam as especificidades destas no reconhecimento de NLSs, dependendo do organismo e função que exercem. Ou seja, um mesmo peptídeo NLS pode apresentar variações na afinidade e no modo de ligação quando interage com Imp± de famílias distintas. O objetivo desse projeto é comparar a afinidade e o modo de ligação de um mesmo peptídeo NLS com proteínas Imp± das famílias ±1 e ±2. Os NLSs que serão utilizados nesse projeto são de fatores de transcrição do fungo Neurospora crassa e os resultados desse estudo poderão contribuir com a identificação de especificidades dos NLSs na interação com a Imp± de N. crassa (NcImp±). Inicialmente, serão analisadas as afinidades das interações de um mesmo peptídeo NLS de fungo com as NcImp± (família ±1) e a Imp± de Mus Musculus (MmImp±-família ±2). Em seguida, os complexos NcImp±/peptídeos NLS e MmImp±/peptídeos NLS serão submetidos a experimentos de cristalização e os melhores cristais submetidos a difração de raios-X, coleta e processamento dos dados. Após etapas de modelagem e refinamento, as estruturas dos complexos serão elucidadas e comparadas para verificar especificidades, a nível estrutural, na interação de um mesmo peptídeo NLS com Imp± de diferentes famílias. Adicionalmente, visando quantificar as interações entre estes peptídeos NLS e as MmImp± e NcImp±, serão realizados experimentos de calorimetria de por titulação isotérmica (ITC) que pode fornecer a constante de dissociação, estequiometria, entalpia e entropia das interações. O presente projeto está vinculado a Projeto Temático (proc.2013/24705-3). (AU)