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Silenciamento gênico de Diatraea saccharalis utilizando a técnica de RNA de interferência (RNAi)

Processo: 17/17882-7
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2017
Vigência (Término): 31 de julho de 2021
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Antonio Vargas de Oliveira Figueira
Beneficiário:Bruna Garbatti Factor
Instituição-sede: Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ). Universidade de São Paulo (USP). Piracicaba , SP, Brasil
Assunto(s):Inativação gênica   Interferência de RNA   Diatraea saccharalis   CRISPR-Cas9   Bactérias

Resumo

A lagarta Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae) é o inseto-praga de maior relevância da cana-de-açúcar no Brasil. Sua forma larval é o estágio do inseto que causa os maiores danos, uma vez que se desenvolve no interior dos colmos, dificultando seu controle. O uso do silenciamento gênico do inseto-alvo por meio da técnica de RNA de interferência (RNAi) representa uma estratégia de controle promissora. A eficiência do RNAi para controle de insetos-praga varia em função das espécies alvo, do modo de entrega do dsRNA e dos genes alvos a serem silenciados. O modo de entrega potencial de RNA fita dupla (dsRNA) a pragas agrícolas inclui a produção de plantas transgênicas expressando versões invertidas (hairpin) de genes do inseto alvo e a pulverização de moléculas dsRNA sintéticas. Uma outra alternativa a considerar seria o uso de bactérias transformadas expressando dsRNA por apresentar custos menores, por permitir a produção em larga escala, e que ainda, protege as moléculas de dsRNA da degradação, contribuindo deste modo, para maior eficiência da técnica. Neste contexto, bactérias endofíticas geneticamente modificadas oferecem potencial de uso para colonizar o hospedeiro e produzir dsRNA para o controle de insetos-pragas. O objetivo deste projeto será avaliar o uso de bactérias, Escherichia coli HT115 (DE3) e a endofítica Pantoea agglomerans 33.1 como forma de entrega de dsRNA correspondente a genes alvos do inseto, pretendendo validar a utilização destas bactérias expressando dsRNA para o controle da D. saccharalis. Serão construídos vetores de expressão de dsRNA de genes alvos de D. saccharalis utilizando o plasmídeo L4440, que serão utilizados para transformação das duas espécies bacterianas. As bactérias expressando dsRNA serão fornecidas via dieta artificial a lagartas de D. saccharalis, em bioensaios cujos parâmetros serão otimizados. Ainda, para aumentar a eficiência, será realizado o knockout do gene da enzima RNaseIII de P. agglomerans 33.1 por edição genômica (CRISPR-Cas9) para permitir o acúmulo de maior concentração de dsRNA a ser fornecido ao inseto. Espera-se observar o potencial do uso das bactérias geneticamente modificadas, E. coli HT115 (DE3) e a endofítica P. agglomerans 33.1, para silenciamento gênico e controle de D. saccharalis, via RNAi. Por fim, os genes que apresentarem melhores resultados nos ensaios com bactérias, serão selecionados para serem utilizados em construções de "plantas RNAi" transgênicas de cana-de-açúcar. (AU)