Desenvolvimento de sistema para expressão heteróloga do agrupamento gênico da neurotoxina anatoxina-a(s)

• Processo: 17/22945-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2018
• Data de Término da vigência: 28 de fevereiro de 2019
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Saúde Coletiva - Saúde Pública
• Pesquisador responsável: Marli de Fátima Fiore
• Beneficiário: Stella de Lima Camargo
• Supervisor: Bradley S. Moore
• Instituição Sede: Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA). Universidade de São Paulo (USP). Piracicaba , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of California, San Diego (UC San Diego), Estados Unidos
• Vinculado à bolsa: 17/06869-0 - Expressão heteróloga, purificação e caracterização de enzimas envolvidas na via biossintética da neurotoxina cianobacteriana anatoxina-a(s), BP.DR
• Assunto(s): Toxinas Cianobactérias Cianotoxinas Biossíntese Análise de sequência de DNA
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cyanobacteria | expression | heterologous system | neurotoxin | organophosphate | Public Health | Toxina de cianobactérias

Resumo

Sphaerospermopsis torques-reginae é uma espécie de cianobactéria planctônica com ampla distribuição em diferentes ambientes aquáticos brasileiros. Algumas linhagens dessa espécie são conhecidas por produzir o organofosforado anatoxina-a(s) (ANS), um potente inibidor irreversível da acetilcolinesterase, uma enzima que atua no sistema nervoso periférico dos mamíferos. Embora a estrutura da ANS tenha sido elucidada, sua via biossintética ainda é desconhecida. Na tentativa de encontrar o agrupamento de genes envolvidos na via biossintética de ANS, nosso grupo de pesquisa realizou o sequenciamento e a montagem do genoma da S. torques-reginae ITEP-024 (cepa brasileira produtora de ANS) como parte do projeto "Expressão heteróloga, purificação e caracterização de enzimas envolvidas na via biossintética da neurotoxina cianobacteriana anatoxina-a(s)" (FAPESP n° 2017/06869-0). A sequência do genoma permitiu a detecção de um agrupamento de genes potencialmente envolvido na produção de ANS. Esse agrupamento, com um tamanho de 10,9 kb e oito genes biossintético, é adequado para ser expresso em um sistema de expressão heteróloga, uma estratégia essencial para aumentar o conhecimento e engenharia de vias de produtos naturais potencialmente interessantes. Assim, o objetivo desta proposta de pesquisa é desenvolver um sistema usando a clonagem de recombinação associada à transformação (TAR) do agrupamento de genes de ANS. A plataforma genética baseada em TAR permite clonar, manipular e expressar heterologamente a via biossintética completa. Dessa forma, as células de S. torques-reginae ITEP-024 serão cultivadas em meio líquido ASM-1 durante 21 dias e utilizadas para a extração do DNA genômico o qual será usado na preparação de vetores de captura do agrupamento gênico e fragmentos TAR. Posteriormente, a clonagem direta e a expressão do agrupamento de ANS serão realizadas. Esses experimentos têm como objetivo avaliar a produção de ANS pela via biossintética proposta. Após a expressão no sistema heterólogo desenvolvido, a produção de ANS será avaliada por análises químicas usando métodos de espectrometria de massa. O uso da clonagem pelo método de TAR para capturar diretamente o agrupamento de genes no DNA genômico oferece uma maneira rápida e eficiente de produção e manipulação genética, permitindo uma investigação rápida e detalhada de caminhos biossintéticos promissores. Esta pesquisa contribuirá para a compreensão da via biossintética da cianotoxina ANS e para o desenvolvimento de métodos rápidos e sensíveis na detecção e monitoramento desta toxina em águas utilizadas para o abastecimento público. (AU)