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Proteômica quantitativa da cromatina frente ao tratamento com FGF2: análise da regulação transcricional e associação de cdc42

Processo: 17/18344-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de janeiro de 2018
Vigência (Término): 29 de fevereiro de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica
Pesquisador responsável:Julia Pinheiro Chagas da Cunha
Beneficiário:Francisca Nathália de Luna Vitorino
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:13/07467-1 - CeTICS - Centro de Toxinas, Imuno-Resposta e Sinalização Celular, AP.CEPID
Assunto(s):Proteômica   Cromatina   Fator 2 de crescimento de fibroblastos   Proteína cdc42 de ligação ao GTP

Resumo

A cromatina tem uma função importante em processos celulares essenciais tais como mitose, transcrição, replicação, reparo, dentre outros. O fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) apesar de induzir proliferação celular em diversos contextos, inibe irreversivelmente a proliferação de células tumorais de camundongos (linhagem Y1) na transição G2/M do ciclo celular. Para entender melhor o mecanismo molecular induzido por este fator, nosso grupo realizou diversas análises proteômicas utilizando extratos totais e de proteínas associadas à cromatina dessas células após estímulo com FGF2. Nas análises proteômicas quantitativas da cromatina identificamos cerca de 1660 proteínas e 169 delas foram encontradas diferencialmente expressas em amostras estimuladas com FGF2. Diversas proteínas associadas à regulação transcricional são down regulados após estímulo com FGF2 enquanto que a proteína cdc42, uma Rho GTPase, está aumentada. Como estão descritas associações diretas e indiretas entre RhoGTPases e regulação transcricional, particularmente via regulação da fosforilação da porção carboxi-terminal (CTD) da RNA Pol II pretendemos, na continuação deste projeto para doutorado, explorar melhor os efeitos de FGF2 na cromatina modulando os níveis transcricionais e, ainda, investigar se cdc42 participa desta modulação. Como a presença desta proteína na cromatina é um achado novo na literatura, este projeto também pretende investigar isso em maiores detalhes. Assim, os níveis transcricionais serão avaliados por ensaios de Run-on (EU e BrUTP) utilizando ou não inibidores específicos das RNA Polimerases I e II e o status de fosforilação do CTD da RNA Pol II será avaliado por ensaios de western blotting. A localização de cdc42 na cromatina será avaliada por microscopia confocal, ChIP e ensaios de western blotting utilizando diferentes protocolos de obtenção da cromatina. células Y1 expressando cdc42 constitutiva ativa (cdc42-V12) ou inativa (CDC42-N17) assim como knockdown para cdc42 serão obtidos e os níveis transcricionais e de fosforilação do CTD da RNA Pol II serão avaliados. Tais células serão também avaliadas quanto a sensibilidade ou resistência aos efeitos citotóxicos induzidos pelo estímulo por FGF2. (AU)