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Importância da atividade secretora de macrófagos induzida pela crotoxina sobre as funções de fibroblastos envolvidas com o processo de cicatrização. estudos in vitro

Processo: 17/23974-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de março de 2018
Vigência (Término): 29 de fevereiro de 2020
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina
Convênio/Acordo: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Pesquisador responsável:Sandra Coccuzzo Sampaio Vessoni
Beneficiário:Luiz Aurélio de Campos Crispin
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Crotoxina   Fibroblastos   Biologia celular   Cicatrização   Imunomodulação   Macrófagos

Resumo

Diversos estudos mostraram que a Crotoxina (CTX), toxina majoritária do veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt), apresenta, in vivo e in vitro, ações anti-inflamatória e imunomoduladora. No que concerne às atividades imumoduladoras, a CTX estimula, em particular, o metabolismo de macrófagos e a produção de citocinas, lipoxina A4 e análogo 15-Epi-LXA4, por essas células, levando à inibição dos eventos envolvidos com a progressão tumoral e angiogênese. Em relação às ações anti-inflamatórias, a CTX induz importante inibição sobre os eventos vascular e celular da resposta inflamatória induzida por agentes flogísticos, apresentando efeito de maior magnitude aos induzidos por anti-inflamatórios clássicos. A resposta inflamatória regenerativa/cicatrização envolve fundamentalmente três fases: inflamação, formação de tecido de granulação e deposição de matriz extracelular e remodelação. Particularmente, com a presença local de macrófagos derivados de monócitos e a produção e liberação dos mediadores químicos produzidos por eles, a migração e ativação de fibroblastos é intensificada, levando à deposição de grandes quantidades de fibronectina e colágeno, favorecendo a cicatrização. Portanto, a adequada ativação dos macrófagos é crucial a adequada resolução da regeneração tecidual local. Assim, o objetivo do presente projeto é investigar a importância da atividade secretora de macrófagos induzida pela CTX sobre as funções de fibroblasto envolvidas com o processo de cicatrização. Para tanto, monoculturas de macrófagos diferenciados a partir da linhagem monocítica humana THP-1 serão incubados com diferentes concentrações da CTX, por 2 horas, lavados e incubados com meio RPMI 1640 fresco, por 24 horas e após esse período, fibroblastos humanos serão incubados com os sobrenadantes dessas monoculturas (cel:sobrenadante) ou com os macrófagos (cel:cel) para a determinação in vitro dos eventos dos fibroblastos, em diferentes períodos, tais como: 1) ensaio de proliferação; 2) ensaio de migração no modelo de Wound healing; 3) ensaio de migração em Câmara de transwell; 4) morfologia do citoesqueleto de actina dos fibroblastos e expressão de fibronectina e colágeno tipo I secretados por essas células, visualizados por microscopia confocal; 5) as alterações nas propriedades viscoelásticas do citoesqueleto dos fibroblastos, por meio da Citometria Óptica de Torção Magnética (OMTC) e 6) quantificação de IL-10, TNF-±, VEGF, TGF-², por ensaio imunoenzimático (EIA). Como controles serão mantidas, em paralelo, monoculturas das diferentes células tratadas ou não com a CTX ou anti-inflamatórios clássicos. Os dados obtidos com o presente projeto contribuirão de forma importante com a ampliação da caracterização da propriedade anti-inflamatória da CTX, evidenciando a importância da atividade moduladora da toxina sobre macrófagos para esta propriedade e a possível participação dos fibroblastos, células cruciais para o processo de regeneração e cicatrização tecidual. (AU)