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Diversidade biológica de ASNAses: avaliação da evolução das enzimas e determinação da estrutura cristalográfica de ASNaseM

Processo: 18/04685-1
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto
Vigência (Início): 13 de maio de 2018
Vigência (Término): 12 de novembro de 2018
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Marcos Antonio de Oliveira
Beneficiário:Leonardo Schultz da Silva
Supervisor no Exterior: Paul Frederick Long
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IB-CLP). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
Local de pesquisa : King's College London, Inglaterra  
Vinculado à bolsa:14/22039-9 - Caracterização funcional, estrutural e modificação racional da ASPaseM: um novo fármaco para o tratamento da anemia linfóide aguda?, BP.DD
Assunto(s):Evolução molecular   Asparaginase   Biofármacos   Elementos estruturais de proteínas   Indústria farmacêutica

Resumo

Asparaginases bacterianas (ASNase) são enzimas tetraméricas de alto peso molecular (~ 140kDa) utilizadas como proteínas terapêuticas para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA), uma vez que alguns tipos de células tumorais dependem da disponibilidade de L-asparagina extracelular. A ASNase bacteriana hidroliza eficientemente aparagina (L-Asn) em ácido aspártico (L-Asp) e amônia, diminuindo a fonte de L-Asn para células tumorais. As indústrias farmacêuticas internacionais produzem ASNase de Escherichia coli (EcA) e Erwinia Chrysantemi (ErA), no entanto, não são produzidas por empresas farmacêuticas brasileiras. Além disso, apesar de ser uma droga amplamente utilizada, vários efeitos colaterais estão associados aos usos da ASNase, incluindo reações imunológicas, neurotoxicidade e anormalidades de coagulação. A fim de reduzir as reações adversas causadas pela terapia com EcA, desenvolveu PEG-ASNase, que tem vantagem de ter uma meia-vida biológica mais longa do que a ASNase nativa, contudo, tem menor imunogenicidade. No entanto, foi demonstrado que existem reações cruzadas entre ASNase nativa e PEG-ASNase, impedindo a mudança de uma para outra. A alternativa é a substituição com ASNase de Erwinia chrysanthemi, ErA, que provoca uma estimulação reduzida do sistema imunológico, embora mostre uma meia-vida biológica menor do que EcA, no entanto, 33% dos pacientes ainda apresentam reações alérgicas à formulação. Portanto, é essencial a exploração de novas fontes de ASNases, a fim de aumentar sua disponibilidade como biofármaco, reduzir os efeitos colaterais e evitar falhas de tratamento devido a flutuações na produção. Considerando as vantagens do uso de microorganismos no bioprocesso e que muito pouco se sabe sobre a enorme magnitude da diversidade microbiana, eles podem ser considerados como fontes de novas ASNases com propriedades melhoradas em comparação com as atualmente empregadas na terapia ALL. Neste trabalho, clonamos, expressamos e purificamos uma enzima, chamada Asp1 de Saccharomyces cerevisiae, com alta homologia com as contrapartes bacterianas (~ 36% de identidade e ~ 54% de similaridade), no entanto, a enzima Asp1 apresenta características estruturais únicas, como uma Cauda N-terminal contendo ~ 50 aminoácidos. Também padronizamos metodologias para a sua expressão e purificação, e as experiências de cromatografia de exclusão por tamanho revelaram uma enzima monomérica (~ 45 kDa) com atividade elevada de asparaginase (~ 110 UI / mg) e apresentada como glutaminase- enzima livre, características interessantes que o tornariam menos enzima imunogênica e apresentavam aplicações em terapia de outros tipos de câncer. Além disso, a enzima ASNaseM apresentou atividade citotóxica nas células neoplásicas semelhante à observada para a enzima bacteriana, sugerindo uma alternativa potencial no tratamento da ALL. Neste contexto, a estrutura da cristalografia seria essencial para compreender as características estruturais únicas da enzima. Além disso, observou-se que a cauda N-terminal está presente apenas em um grupo muito pequeno de leveduras (<10 espécies) e uma análise preliminar indica uma alta variabilidade das enzimas entre os reinos da vida. Neste contexto, uma abordagem interessante baseia-se no estudo in silico da estrutura primária e terciária / quaternária com o objetivo de uma melhor compreensão da variabilidade da ASNase para classificar os diferentes tipos de enzimas em diferentes famílias quanto a características evolutivas, possíveis diferenças na eficiência catalítica e características estruturais. (AU)