Seletividade atrial de um receptor nuclear complexo pelo receptor de andrógeno: uma nova rede gênica

• Processo: 18/09839-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2018
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2019
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biologia Geral
• Pesquisador responsável: José Xavier Neto
• Beneficiário: Luana Nunes Santos
• Supervisor: Mirana Soa Manarivo Ramialison
• Instituição Sede: Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (Brasil). Campinas , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Monash University, Austrália
• Vinculado à bolsa: 15/12549-2 - Identificação das redes genéticas que interagem com COUP-TF II para determinar a identidade atrial em células cardíacas através do promotor do gene SMyHC III, BP.DD
• Assunto(s): Biologia do desenvolvimento Sistema cardiovascular Processos moleculares Receptores androgênicos CRISPR-Cas9 Cultura primária de células Cadeias pesadas de miosina
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Androgen receptor | atrial programming | CRISPR Cas9 | DamID | Primary Cell Culture | Slow Myosin Heavy Chain III (SMyHC III) | Biologia do Desenvolvimento

Resumo

O desenvolvimento cardíaco é um processo complexo que requer inúmeros movimentos morfogenéticos, além da participação de múltiplas redes gênicas regulatórias. Numerosos processos moleculares organizam o tubo cardíaco embrionário em unidades funcionais de influxo (átrio) e efluxo (ventrículo), mas os mecanismos de expressão de câmara ainda são pouco compreendidos. Apenas um punhado de genes cardíacos é conhecido por ser expresso de maneira específica nas câmaras cardíacas. Genes como os fatores de transcrição Gata-4, Tbx-5, Tbx-20 e COUP-TFII (chicken ovalbumin promoter-transcription factor II) são mais proeminentemente expressos no influxo cardíaco, enquanto IRX-4, MLC2-V e HRT-2 são principalmente expressos nos ventrículos. O gene Slow Myosin Heavy Chain III (SMyHC III) é expresso seletivamente em átrios de corações embrionários de codornas e é um paradigma útil para entender os mecanismos de expressão das câmaras cardíacas. Em camundongos, o transgene SMyHCIII-HAP exibe uma forte expressão do repórter da fosfatase alcalina na região do coração ocupada pelos precursores de influxo cardíaco em embriões a partir de 8,25dpc até a idade adulta. Esta preferência atrial exibida pelo promotor SMyHC III atravessa as barreiras de espécies e, portanto, se manifesta em aves, mamíferos e até em peixes teleósteos. A deleção de 72 pb distais na região promotora de 840 bp do SMyHC III resultou na expressão ventricular e redução da expressão atrial do gene repórter, mostrando que esse fragmento de 72 pb é essencial para a expressão atrial. Portanto, dada a importância do fragmento de 72 pb na ativação atrial específica e na repressão ventricular da expressão de SMyHC III, realizamos análises de bioinformática, experimentos in vitro e in vivo para identificar novos agentes na regulação do gene SMyHC III. Encontramos múltiplos sítios de ligação para fatores de transcrição da família de receptores nucleares, abrangendo uma região de 32pb denominada de Elemento Complexo de Receptor Nuclear (cNRE). Esta região de 32pb tem mostrado a presença de repressores ventriculares e ativadores atriais para diversos fatores de transcrição da superfamília de receptores nucleares. Nossos ensaios de transativação em células Hek293T mostraram uma nova rede de regulação gênica na especificação da câmara cardíaca, a via do Receptor de Androgênio (AR). Neste contexto, propomos investigar as interações proteína-cromatina que controlam o promotor atrial específico do gene SMyHC III usando cultura primárias de células do coração de embriões de codornas com Receptor de Androgênio (AR) fundido ao DamID seguido por sequenciamento de DNA de alto rendimento. A tecnologia DamID é uma abordagem alternativa para detectar a interação proteína-cromatina em escala genômica à imunoprecipitação da cromatina (ChIP). Vamos fundir o gene do Receptor de Androgênio (AR) em DamID em celulas de cultura primária de codorna, tanto em células normais quanto em células com cNRE deletados por CRISPR para detectar e localizar a interações proteína-DNA na regulação do gene SMyHCIII e compreender o mecanismo molecular necessário para a programação atrial. (AU)