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Sinalização da insulina no corpo lúteo bovino e canino sob influência de concentrações altas e baixas de 17²-estradiol

Processo: 18/09579-5
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de junho de 2018
Vigência (Término): 30 de novembro de 2018
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Pesquisador responsável:Paula de Carvalho Papa Keohane
Beneficiário:Giovanna Nalin Parmegiani
Instituição-sede: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:14/00739-9 - Sinalização da insulina no corpo lúteo bovino e canino sob influência de concentrações altas e baixas de 17²-estradiol, AP.TEM
Assunto(s):Fisiologia da reprodução   Corpo lúteo   Vacas   Cães   Insulina   Peptídeos e proteínas de sinalização intracelular

Resumo

O objetivo desse projeto é identificar componentes da via de sinalização da insulina para captação de glicose e esteroidogênese de acordo com as variações cíclicas de 17²- estradiol (E2) no corpo lúteo (CL) cíclico e gestacional na espécie canina e cíclico na bovina, e nesta espécie resultante ou não de tratamentos com eCG. Para tal, no experimento (exp.) 1 serão utilizadas 16 vacas (Bos taurus taurus), as quais serão sincronizadas e metade delas tratadas com propilenoglicol para aumento da insulina circulante a partir de 72 h antes da aplicação de LH para ovulação. No exp. 2, novilhas taurinas serão sincronizadas e tratadas com 400 UI de eCG, 3 d após a ovulação. No exp. 1, as vacas terão os folículos aspirados para coleta de células da granulosa e em um outro ciclo, não ocorrerá aspiração folicular e os CLs de D6, D10 e D14 serãobiopsiados. Este procedimento de biopsia luteal também será conduzido no exp. 2. A expressão gênica global será determinada através do sequenciamento de RNA (RNA- seq), a partir do qual serão selecionados genes diferencialmente expressos relacionados à via de sinalização da insulina para validação por qPCR, western blotting e imuno- histoquímica. No exp. 3, amostras de CL provenientes de vacas cíclicas, tratadas ou não com eCG e previamente analisadas por microarranjo, serão validadas para genes da via de sinalização insulínica da maneira já descrita acima. No exp. 4, 24 cadelas serão castradas na fase de diestro (dias 10 a 60 após a ovulação) e no exp. 5, 18 cadelas gestantes serão castradas nas fases inicial, intermediária e final da gestação. Os CLs serão coletados e também submetidos a RNA-seq e validações. Após obtenção dos resultados provenientes da análise gênica global, avaliaremos in vitro os efeitos da insulina em células luteínicasbovinas (exp. 6) e caninas (exp.7) cultivadas e submetidas a diferentes concentrações de E2. A verificação do papel funcional dos genes selecionados será realizada pela técnica de RNAi e as amostras de cultivo também submetidas ao RNA-seq e posterior validações. As análises de RNA-seq serão realizadas através do alinhamento das sequências geradas (reads) contra o genoma bovino e canino, respectivamente, as quais serão convertidas em transcritos, cujo nível de expressão será estimado através do índice RPKM (reads/Kb/Million). Os dados do sequenciamento serão publicados na biblioteca do NCBI (Sequence Read Arquives - SRA). Após as validações, os resultados obtidos serão testados, através do programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, EUA), de acordo com sua homogeneidade e normalidade e apresentados como média ± EPM. Diferenças de p d 0,05 serão consideradas significativas. Assim, a presente proposta pretende, além de desvendar o papel da insulina na função do CL, revisitar os mecanismos de regulação do CL nas duas espécies abordadas, uma vez que os experimentos de RNA-seq abrirão novas perspectivas de compreensão global deste fenômeno. O bolsista de iniciação científica auxiliará inicialmente nas técnicas de cultivo celular; após obtenção dos resultados pela técnica de RNA-seq ajudará nas validações dos genes diferencialmente expressos em cadelas não gestantes (PCR em tempo real, western blotting e imuno-histoquímica) para a exploração das vias selecionadas nas análises globais.