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O papel da deleção do alvo ob da Rspo3 na homeostase esqueletal dos ossos do adulto

Processo: 18/04795-1
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 02 de julho de 2018
Vigência (Término): 01 de julho de 2019
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Odontologia
Pesquisador responsável:Marcia Martins Marques
Beneficiário:Ana Clara Fagundes Pedroni
Supervisor no Exterior: Roland Baron
Instituição-sede: Faculdade de Odontologia (FO). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : Harvard University, Boston, Estados Unidos  
Vinculado à bolsa:17/00760-6 - Efeito da cell sheet de células-tronco da polpa dentária humana, associada ou não à terapia de fotobiomodulação, na regeneração de lesões ósseas críticas em calvárias de ratos portadores de diabetes mellitus tipo 2, BP.DR
Assunto(s):Regeneração óssea   Via de sinalização Wnt

Resumo

Diabetes pode levar a alterações ósseas metabólicas que promovem um estado desequilibrado na massa óssea, semelhante à osteoporose. A via de sinalização WNT já foi descrita como envolvida na formação do esqueleto, regeneração óssea e diferenciação de células-tronco mesenquimais na linhagem óssea - sendo uma importante via de interesse no tratamento de distúrbios do volume ósseo. Estudos anteriores do grupo de pesquisa do Dr. Baron descobriram que os genes RSPOs são ativadores de sinalização Wnt e que a sinalização Wnt tem papéis fundamentais no desenvolvimento ósseo e na homeostase o que sugere que as RSPOs poderiam ter funções importantes nesses processos. Os resultados preliminares mostram: 1) que o RSPO3 é expresso em osteoblastos e células estromais da medula óssea, 2) que o RSPO3 ativa a sinalização canônica de Wnt e 3) que os ratos RSPO3 heterozigotos exibem um fenótipo ósseo caracterizado pelo aumento da formação óssea e da massa óssea. O objetivo principal do estudo aqui proposto é explorar o papel da deleção do alvo OB do gene RSPO3 em ossos adultos. Para este propósito, usaremos os ratos transgênicos Col1a1-CreERT2. Estes animais tem um sistema de recombinação mediado por Cre-indutível por TM conduzido pelo promotor Col1a1 de 2,3 Kb de rato. A proteína de fusão Col1a1-CreERT2 não liga o ligante natural (estrogênio) em concentrações fisiológicas, mas irá ligar o ligante sintético, 4-hidroxiTM (4-OHT) e obter acesso ao compartimento nuclear para mediar a recombinação após exposição à TM exógena. Métodos: Os ratos transgênicos (Col1a1-CreERT2 / Rspo3f / f e Col1a1-CreERT2 / Rspo3f / wt) e os ratos controle de 12 semanas de idade serão injetados intraperitorialmente com 1mg / 10g de peso corporal de TM ou veículo todos os dias durante 5 dias ( 3 injeções) e sacrificados 4 semanas após a última injeção, às 16 semanas de idade. A eficiência de deleção será verificada por PCR de DNA genômico extraído de ossos longos e calvárias. Para garantir que a recombinação de genes induzida por TM seja alcançada, a expressão de RNA do Rspo3 e os níveis de proteína serão avaliados por qRT-PCR e análises por Western blot e de imunoistoquímica, respectivamente. Membros posteriores, vértebras e calvárias serão coletadas para análise de raios-X e densitometria óssea, microCT, histomorfometria dinâmica, propriedades biomecânicas e marcadores bioquímicos de formação e de reabsorção ósseas serão medidas. Relevância da pesquisa: Delinear o papel da RSPO3 na homeostase da massa óssea pós-natal e os mecanismos pelos quais esta proteína ativa a via de sinalização Wnt, que tem relevância para a compreensão da homeostase óssea e podem ter importantes implicações para a geração de novas abordagens terapêuticas anabolizantes para tratar a osteoporose e outras doenças associaadas à baixa massa óssea e aumento da fragilidade óssea, como as encontradas em pacientes diabéticos.

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