Asparaginase1 de Saccharomyces cerevisiae: investigação dos efeitos funcionais e estruturais da cauda N-terminal

• Processo: 17/25272-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Vigência (Início): 01 de julho de 2018
• Vigência (Término): 30 de junho de 2019
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Marcos Antonio de Oliveira
• Beneficiário: Gabriella Costa Fernandes
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB-CLP). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/08617-7 - Produção de L-asparaginase extracelular: da bioprospecção à engenharia de um biofármaco antileucêmico, AP.TEM
• Assunto(s): Leucemia-linfoma linfoblástico de células precursoras Biofármacos Antineoplásicos Asparaginase Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli Resposta imune
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: asparaginase | N-terminal | Saccharomyces cerevisiae | Biologia Molecular e Estrutural

Resumo

O tratamento da leucemia linfoide aguda (LLA) é comumente realizado pelo uso de asparaginases bacterianas (ASNase) como a de Escherichia coli (EcA) nativa ou conjugada com polietilenoglicol (PEG-EcA) ou de Erwinia chrysanthemi (ErA). Estas enzimas são homotetraméricas e apresentam elevada massa molecular (~140 kDa). Sua atividade antitumoral baseia-se na incapacidade de células leucêmicas de produzir o aminoácido l-asparagina (Asn) em níveis adequados, necessitando utilizar o Asn da corrente sanguínea. As ASNases catalisam a reação de hidrólise de Asn em aspartato (Asp) e amônia (NH3), depletando a fonte de Asn para as células neoplásicas ocasionando apoptose. Adicionalmente, as ASNases possuem atividade secundária de glutaminase (GLNase), hidrolisando o aminoácido glutamina (Gln) em ácido glutâmico (Glu) e NH3, atividade relacionada com uma série de efeitos colaterais, incluindo respostas imunológicas e reações alérgicas que podem levar a choques anafiláticos. Em alguns casos, a própria EcA pode causar efeitos imunológicos, o que pode ser sanado pela introdução de moléculas de PEG no fármaco. Entretanto, tal alteração pode ocasionar reação cruzada pela ação dos anticorpos anti-EcA, e a substituição por ErA representa uma alternativa. No entanto, parte dos pacientes ainda apresentam respostas imunológicas. Desta forma, a busca de novas ASNases apresenta grande importância na obtenção de enzimas alternativas e/ou com menores efeitos adversos. Cabe ressaltar que no Brasil somente a EcA, nativa e peguilada possuem o certificado da ANVISA o que pode prejudicar o tratamento de pacientes com LLA. Recentemente, nosso grupo de pesquisa caracterizou uma nova ASNase oriunda de Saccharomyces cerevisiae (Asp1), com elevada afinidade por Asn e alta citotoxicidade para células tumorais de LLA. No entanto, quando expressa em condições oxidantes, experimentos de cromatografia de exclusão molecular revelaram uma enzima monomérica, com aproximadamente ¼ da massa molecular quando comparada com as enzimas bacterianas, uma característica bastante importante, pois o reduzido tamanho tende a diminuir os efeitos imunogênicos. A análise da sequência de aminoácidos de Asp1 revelou a presença de uma extensão N-terminal de aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos ausente nas enzimas EcA e ErA, e observada apenas em um grupo muito pequeno de leveduras (< 10 espécies). De fato, esta porção da proteína pode estar relacionada com sua atividade como monômero e também estar relacionado para qual compartimento celular a enzima deve migrar em S. cerevisiae ou mesmo ser exportada, como o observado para a isoforma Asp3. Neste contexto, a expressão recombinante em bactérias em condições oxidantes, que resulta na formação de monômero com alta atividade, pode reproduzir uma enzima com característica similar à proteína nativa. Contudo, até o presente momento nenhum trabalho atentou para investigar a função desta porção proteica de Asp1. Este projeto tem como objetivo avaliar se existe função sinalizadora desta porção e também avaliará a deleção da cauda N-terminal sobre a atividade e estrutura da enzima Asp1, utilizando construções para a proteína truncada (Asp1”NT) e a selvagem fusionada a eGFP para determinar localização celular. Para tanto serão utilizadas metodologias envolvendo biologia molecular (construção Asp1”NT e Asp1wt- eGFP), análises bioquímicas (testes de atividade de ASNase e GLNase), biofísicas (dicroísmo circular - estrutura secundaria; cromatografia de exclusão molecular - estrutura terciária/quaternária; deslocamento térmico - estabilidade) e celulares (microscopia de fluorescência - determinação de localização celular). Acreditamos que os resultados obtidos neste projeto auxiliarão significativamente na caracterização da enzima Asp1, visando um potencial biofármaco alternativo para a LLA.

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

DE MOURA, WERNER ALFINITO FEIO; SCHULTZ, LEONARDO; BREYER, CARLOS ALEXANDRE; DE OLIVEIRA, ANA LAURA PIRES; TAIRUM, CARLOS ABRUNHOSA; FERNANDES, GABRIELLA COSTA; TOYAMA, MARCOS HIKARI; PESSOA-JR, ADALBERTO; MONTEIRO, GISELE; DE OLIVEIRA, MARCOS ANTONIO. Functional and structural evaluation of the antileukaemic enzymel-asparaginase II expressed at low temperature by differentEscherichia colistrains. Biotechnology Letters, v. 42, n. 11, p. 12-pg., 2020-07-07. (13/08617-7, 11/13500-6, 16/19245-1, 17/25272-4, 19/04054-4, 17/19942-7, 14/22039-9, 17/20291-0)

DE MOURA, WERNER ALFINITO FEIO; SCHULTZ, LEONARDO; BREYER, CARLOS ALEXANDRE; DE OLIVEIRA, ANA LAURA PIRES; TAIRUM, CARLOS ABRUNHOSA; FERNANDES, GABRIELLA COSTA; TOYAMA, MARCOS HIKARI; PESSOA-JR, ADALBERTO; MONTEIRO, GISELE; DE OLIVEIRA, MARCOS ANTONIO. Functional and structural evaluation of the antileukaemic enzymel-asparaginase II expressed at low temperature by differentEscherichia colistrains. Biotechnology Letters, JUL 2020. (13/08617-7, 17/19942-7, 17/25272-4, 19/04054-4, 14/22039-9, 16/19245-1, 17/20291-0, 11/13500-6)