Resumo
A aplicação de kits de imunodiagnósticos para diversas doenças que afetam a espécie humana é uma das ferramentas mais rápidas e seguras, permitindo o tratamento precoce dessas doenças. Para a produção destes kits, em um primeiro momento, é necessária a produção de proteínas ou peptídeos recombinantes de alvos específicos dos patógenos, com elevado grau de pureza e que repliquem as características estruturais e conformais da proteína nativa, e, em um segundo momento, anticorpos monoclonais com alta sensibilidade e afinidade, garantido um diagnóstico precoce, eficiente, rápido e preciso. A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é o câncer mais comum na infância. A proteína Stanniocalcina 1 (STC-1) foi identificada como sendo um potencial soro marcador da LLA, útil para fins de acompanhamento da resposta clínica ao tratamento. Este projeto visa dar continuidade aos resultados obtidos na fase I e completar o sistema de detecção baseado em ELISA Sandwich, através da produção de um painel de anticorpos monoclonais a partir da proteína recombinante STC-1 e com isso, otimizar, padronizar e validar um kit diagnóstico precoce, com alta sensibilidade e confiança capaz de detectar e diferenciar os níveis de STC-1 circulantes em amostras biológicas de pacientes não doentes e leucêmicos. Assim, a partir da expressão e purificação do gene da proteína STC-1 em sistema de baculovírus/células de inseto, será adotada duas estratégias para a produção de anticorpos monoclonais, com a imunização de: 1) camundongos Balb/C e 2) camundongos transgênicos GANP (germinal center-associated nuclear protein). Estes transgênicos têm aumento de atividade de hipermutação somática das regiões V dos genes de imunoglobulinas, resultando em produção de maior diversidade de anticorpos, logo, aumentando a chances de obter anticorpos com maior afinidade e especificidade. A proteína STC-1 completa será produzida através da infecção das células com a cultura de baculovírus e purificada por cromatografia em três etapas: 1) troca iônica; 2) afinidade a níquel e 3) exclusão molecular. Como todo kit diagnóstico apresenta um controle positivo e uma curva padrão, a expressão da porção C-terminal de STC-1 em sistema procarioto será outro objetivo a ser concluído, e para isso, linhagens de E. coli como roseta e C43 serão empregadas em associação com tampões de solubilização e extração na presença de uréia, e ainda protocolos de refolding para a produção desta proteína de forma solúvel. O kit diagnóstico será padronizado com amostras de pacientes não doentes (incluindo grupos controle, como mulheres grávidas) e doentes (incluindo diversos tipos de câncer, para validação de STC1 como marcador de LLA) e será submetido à testes de estabilidade, armazenamento e limite de detecção. Desse modo, este projeto contempla uma plataforma de síntese de proteínas recombinantes bem como de anticorpos monoclonais para a detecção de LLA em pacientes. (AU)
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