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Construção de novas cepas de Saccharomyces cerevisiae tolerantes a condições ácidas e inibidores advindos de pré-tratamento da biomassa

Processo: 18/16191-3
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 01 de novembro de 2018
Vigência (Término): 31 de outubro de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Pesquisador responsável:María Eugenia Guazzaroni
Beneficiário:Luana de Fátima Alves
Supervisor no Exterior: Solange Ines Mussatto Dragone
Instituição-sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Local de pesquisa : Technical University of Denmark (DTU), Dinamarca  
Vinculado à bolsa:16/06323-4 - Novas ferramentas para abordagens metagenômicas na prospecção de celulases, BP.DR
Assunto(s):Engenharia metabólica   Fermentação   beta-Glucosidase   Saccharomyces cerevisiae

Resumo

A degradação da biomassa vegetal tem sido estudada há anos devido à incrível quantidade de subprodutos gerados durante o processo - desde biocombustíveis até outros produtos de valor agregado. O atual projeto de Doutorado visa a desenvolver e aplicar novas ferramentas para melhorar as triagens metagenômicas funcionais, mais especificamente para a triagem de celulases. Bibliotecas metagenômicas foram geradas em um vetor de amplo espectro de hospedeiros, a fim de expandir a taxa de identificação de clones positivos em triagens metagenômicas utilizando diferentes hospedeiros. Uma nova ²-glicosidase foi identificada e, entre outras características interessantes, apresentou tolerância a altas quantidades de etanol e 5-hidroximetil furfural (5-HMF), um dos mais importantes inibidores de celulase em hidrolisados de bagaço de cana pré-tratados. Além disso, esta enzima apresentou efeito sinérgico sobre a atividade da endoglucase GH5-CBM3 de Bacillus subtilis, aumentando a quantidade de glicose liberada quando utilizou-se CMC como substrato. Devido à busca contínua de melhores rendimentos na degradação de biomassa, apresentamos a ideia de usar um consórcio de microorganismos modificados. Modificar S. cerevisae, que já é um bom organismo fermentador, para produzir essa ²-glicosidase tolerante a etanol e 5-HMF em combinação com a endoglucanase de Bacillus subtilis GH5-CBM3 (com a qual já demonstramos atuar em sinergia) juntamente com alguns genes que conferem tolerância a condições intrínsecas aos processos de hidrólise e fermentação (por exemplo, tolerância a 5-HMF ou a condições ácidas). Neste sentido, em nosso grupo, trabalhamos com alguns genes (também identificados à partir de triagens metagenômicas) que conferem resistência ácida a E. coli e outras bactérias gram-positivas e gram-negativas (genes clpX, hu e rbp, que apresentam funções da protease, proteína semelhante à histona e proteína de ligação ao RNA, respectivamente). Além disso, esses genes foram transferidos com sucesso para Arabidopsis thaliana e permitiram o crescimento em pH 3,5. Desse modo, com o conhecimento acerca da manipulação de genomas de levedura, podemos criar uma comunidade de várias linhagens diferentes do mesmo organismo, cada uma produzindo diferentes genes, como as enzimas de interesse e/ou genes de resistência. Portanto, os principais objetivos do presente projeto são: (i) aplicar os dados anteriores obtidos no projeto de Doutorado (genes metagenômicos e enzimas de interesse) para modificar S. cerevisiae; (ii) aprender a usar ferramentas genéticas para manipular genomas de levedura; (iii) usar essas ferramentas para criar linhagens de levedura resistentes a condições ácidas e inibidores advindos de pré-tratamento da biomassa e que produzam enzimas de interesse; (iv) aprender sobre processos de hidrólise e fermentação de biomassa e aplicar esse conhecimento para avaliar a eficiência das linhagens geradas. Nosso objetivo final é obter as linhagens mutantes e estabelecer as metodologias manipulação da levedura, bem como do processo de fermentação, e assim trazer esse conhecimento para ser aplicado em nosso laboratório na FFCLRP-USP. Toda a tecnologia e experiência em manipulação de levedura irão gerar avanços significativos na modelagem metabólica e criar uma comunidade de cepas de leveduras que podem resistir a condições adversas e ao mesmo tempo produzir enzimas que degradem biomassa.