Resumo
Nosso modelo in vitro de progressão do melanoma utiliza bloqueio de adesão ao substrato como fator de transformação maligna. As linhagens correspondentes às fases de progressão do melanoma são: melan-a (melanócitos não tumorigênicos), 4C (melanócitos pré-malignos), 4C11- (melanoma não metastático) e 4C11+ (melanoma metastático). Os níveis gênicos e proteicos de TET2 e níveis de 5hmC encontram-se elevados na linhagem 4C11+ em comparação com as outras. Essa linhagem foi escolhida para o silenciamento estável de TET2 e os clones obtidos foram avaliados quanto às capacidades de proliferação, formação de colônias, resistência à dacarbazine, resistência à morte por anoikis e migração coletiva. Elas apresentaram um aumento das capacidades de resistência ao anoikis e migração coletiva.Em estágios avançados de melanoma humano, a perda de TET2 e 5hmC são marcadores de aumento de agressividade e pior prognóstico. Como a linhagem metastática 4C11+ mostrou os maiores níveis de Tet2 e 5hmC, nós hipotetizamos que o microambiente tumoral poderia levar à perda de 5hmC. Portanto, nós estabelecemos linhagens originadas de tumor in situ e metástase pulmonar (linhagens T e M) em camundongos. Essas linhagens mostraram uma diminuição dos níveis gênicos e proteicos de TET2, diminuição dos níveis de 5hmC e aumento das capacidades de formação de colônia, migração coletiva e resistência ao anoikis, em comparação à linhagem 4C11+ e em um padrão consistente entre elas.Utilizando o RT2 Profiler PCR Array kit (QIAGEN), obtivemos um perfil de expressão de genes pró-metastáticos em um clone silenciado para TET2 em comparação com a linhagem parental 4C11+. Alguns genes foram escolhidos para validação por qPCR quantitative e também investigados nas linhagens T e M. Os genes Cdkn2aip, Hmmr and Ncor1, envolvidos com controle do ciclo celular, motilidade e invasão, respectivamente, mostraram perfis distintos entre as linhagens do modelo de progressão do melanoma, clones silenciados para TET2 e as linhagens T e M. Esses perfis simulam as diferentes condições existentes entre essas linhagens, sugerindo um papel ao microambiente tumoral à distribuição de 5hmC e regulação de características agressivas como migração e resistência ao anoikis. Como as linhagens 4C11+, 4C11+shTET2 #3 (clone silenciado para TET2), 4C11+ T1 (linhagem estabelecida de tumor in situ) e 4C11+ M2 (linhagem estabelecida de metástase pulmonar) apresentam características semelhantes em relação à resistência ao anoikis, migração coletiva e formação de colônia, mas diferentes níveis de 5hmC, foram escolhidas para a investigação das mudanças ocorridas durante a progressão do melanoma em estágios avançados, considerando também o papel do microambiente tumoral.O próximo passo nesse estudo será a identificação dos perfis de metilação e hidroximetilação das linhagens escolhidas, sua relação com o metiloma e transcriptoma já obtidos das linhagens de nosso modelo original de progressão do melanoma (melan-a, 4C, 4C11- e 4C11+), avaliação de expressão gênica diferencial e vias complexas, e a validação em bancos de dados de melanoma humano. (AU)
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